NEW HOST RECORD AND STUDY ON INTRASPECIFIC DIFFERENTIATION OF TRICHODINA HYPERPARASITIS CHEN & HSIEH, 1984
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摘要:
为探索重寄生车轮虫(Trichodina hyperparasitis Chen & Hsieh, 1984)种内分化的影响因素, 研究通过广泛采样分离获得寄生于乌鳢(Channa argus)与月鳢(Channa asiatica)鳃部的重寄生车轮虫3个地理株系, 即重庆沙坪坝乌鳢寄生株系(S株系)、重庆大足乌鳢寄生株系(D株系)与贵州凯里月鳢寄生株系(K株系), 其中贵州凯里为重寄生车轮虫的地理新记录, 月鳢为其宿主新记录。结合形态学与分子证据对重寄生车轮虫不同株系进行了比较研究, 基于附着盘形态学量化与主成分分析的研究结果显示: 三地理株系在虫体大小方面存在显著差异, 其中S株系是虫体最大的株系(P<0.05), 也是齿体最长的株系(P<0.05), K株系是齿体数最少的株系; S株系与K株系在附着盘整体结构与齿体形态方面存在一定的种内差异(P<0.05); 基于SSU rDNA序列的株系比较结果显示, K株系与其他2株系间存在10个碱基变异位点, 但3株系间序列相似度为99.45%—100%, 遗传距离为0.001—0.003; 基于SSU rDNA的系统发育分析显示, 重寄生车轮虫与近缘种之间形成了宿主种类特有的单系, 即“鲈形目Perciformes支系”与“鲇形目Siluriformes支系”; 同时在其种内也形成了宿主种群特有的单系, 即“乌鳢支系”与“月鳢支系”。综合研究结果表明, 重寄生车轮虫并非一定营“重寄生”生活, 且偏好寄生于鳢属(Channa)鱼类; 其中乌鳢寄生的两株系间较近缘, 与月鳢寄生的株系间则较远缘, 且各株系间已存在一定程度的遗传分化与形态分化; 推测对于外寄生车轮虫而言, 第一生境即宿主的类型可能是影响车轮虫种间或种群分化最直接的因素。
Abstract:Trichodinid is regarded as one of microscopic parasitic ciliates with high diversity, which is mainly parasitic in fishes, mollusks, some tadpoles of amphibian, and minority of coelenterates in aquaculture. Some trichodinid infections can cause significant damage to their hosts. Trichodinids are diverse and distributed worldwide, with around 400 Trichodina species reported in different environments. However, despite advancements in molecular technology, the research on trichodinids lags behind other ciliate groups mainly due to insufficient or invalid molecular data in GenBank, which inhibited in depth studies. Trichodina hyperparasitis Chen & Hsieh, 1984, a freshwater trichodinid, parasitizes the crustacean Lampraglena chinensis, parasitizing on gills of Channa argus. Consequently, it was named T. hyperparasitis. Reports on T. hyperparasitis are fragmented, and molecular data are nearly blank, underscoring the need for additional valuable data to better understand this species, which is the focus of the present work. In order to explore the factors influencing population differentiation of T. hyperparasitis, three geographic strains were isolated from gills of C. argus and Channa asiatica through extensive sampling. These strains include S strain from C. argus in Shapingba, Chongqing, D strain from C. argus in Dazu, Chongqing, and K strain from C. asiatica in Kaili, Guizhou. Among them, Guizhou represents a new geographic record, and C. asiatica is a new host record for T. hyperparasitis. Three SSU rDNA sequences from the three strains were sequenced and submitted to the GenBank, with further comparative study conducted based on morphological and molecular evidence. Morphological quantization of adhesive disc and PCA showed significant differences among the three geographic strains. The S strain was the largest in body size and denticle span (P<0.05), while K strain was the least one in denticle number (P<0.05). Intraspecific differences were also noted in adhesive disc structure and denticle morphology between both S and K strain (P<0.05). The comparative result of SSU rDNA sequences showed that ten base variant sites between K strain and the others, with a similarity range of 99.45% to 100% and genetic distance ranging from 0.001 to 0.003 among the three strains. The phylogenetic analysis based on SSU rDNA showed that T. hyperparasitis and its related species formed monophyletic lineages specific to host types, including the Perciformes and Siluriformes clades. Additionally, T. hyperparasitis formed host specific monophyletic lineages, viz. C. argus and C. asiatica clades. The comprehensive results indicate that T. hyperparasitis does not necessarily exhibit a hyperparasitic lifestyle and has a strong parasitic specificity to Channa species. Two strains from C. argus are closely related, while the strain from C. asiatica shows greater genetic and morphological divergence. This indicates that the host type, particularly initial habitat, may be the most direct factor influencing interspecific and intraspecific differentiation in ectoparasitic trichodinids.
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Keywords:
- New record /
- Population differentiation /
- SSU rDNA /
- Channa /
- Trichodina hyperparasitis
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车轮虫(Trichodinid)泛指一大类具有特征性圆形附着盘结构以便附着于宿主的游走类纤毛虫, 常包含2个科, 即车轮虫科(Trichodinidae)和壶形虫科(Urceolariidae), 其中以车轮虫科(Trichodinidae)的种类最多, 分布最为广泛, 海淡水均有分布[1]。就寄生部位而言, 由于它们主要寄生于水生动物的体外或靠近体外的部位, 如鱼类的鳃部与体表、贝类的外套腔、两栖类的泄殖腔等, 故常称之为外寄生车轮虫[2—5]。在水产养殖中, 大量暴发的车轮虫常成为水产养殖动物重要的致病病原, 从而引发鱼类种苗的大量死亡, 进而易造成严重的渔业经济损失[6—8]。
乌鳢(Channa argus)俗称乌鱼, 隶属于鲈形目(Perciformes) 鳢科(Channidae) 鳢属(Channa), 主要分布于我国各大水系, 为一类淡水底栖肉食性鱼类; 由于生长快, 肉肥味美加少刺, 故成为重要经济养殖鱼类。月鳢(Channa asiatica) 俗称七星鱼, 同为鳢属底栖鱼类, 主要分布于我国长江以南等地, 因其具较高的食用、药用及观赏价值, 已成为我国的淡水养殖鱼类[9]。二者野生类群极少生病, 养殖类群却频发寄生虫病, 尤其苗种常受车轮虫病害的影响。
重寄生车轮虫(Trichodina hyperparasitis Chen & Hsieh, 1984)是淡水养殖中的车轮虫病原之一, 最早由我国著名学者陈启鎏与谢杏人[10]于1984年首次发现寄生于我国湖北地区的乌鳢(Channa argus)鳃上的中华狭腹鳋(Lampraglena chinensis), 当时发现主要附着于中华狭腹鳋的腹部, 从鳋体上脱落后, 亦可在乌鳢鳃上寄生。由于鳋寄生于乌鳢, 车轮虫寄生于鳋, 进而产生了双重寄生现象, 故名重寄生车轮虫。自该虫被首次定种描述后, 近40年来仅在四川成都与江西鄱阳湖地区的乌鳢鳃上发现其寄生(但并未在乌鳢鳃上发现中华狭腹鳋)[11—13], 迄今暂未发现乌鳢之外的宿主。因此, 重寄生车轮虫是否一定营“重寄生”生活方式? 是否为乌鳢的专性寄生虫或存在宿主偏好性? 如果存在其他宿主, 那么来自不同地区或不同宿主的重寄生车轮虫群体或种群是否存在差异? 这些都是有待进一步解决的问题。此外, 鉴于当前GenBank中缺乏有效的重寄生车轮虫分子数据, 故在一定程度上阻碍了该物种相关研究的纵深拓展。因此, 本研究在广泛采样的基础之上, 首次获得重寄生车轮虫的分子数据, 并基于形态量化与分子数据对重寄生车轮虫进行种群差异性比较研究, 旨在探索影响该类寄生纤毛虫种内分化的因素, 以及与近缘种之间的进化关系, 同时也为水产养殖中车轮虫病害的防治提供第一手的参考资料。
1. 材料与方法
1.1 样本采集与物种鉴定
宿主鱼乌鳢与月鳢于2019—2024年期间分别采自重庆与贵州两地的养殖渔场, 其中乌鳢分别采自于重庆大足区与沙坪坝区, 月鳢采自贵州凯里地区。由于本研究中的重寄生车轮虫分别来自3个不同的地区(重庆大足、重庆沙坪坝和贵州凯里), 因此, 为了后续简要便捷地描述, 现将3个不同地区来源的重寄生车轮虫株系分别命名为重庆大足株系(D株系)、重庆沙坪坝株系(S株系)与贵州凯里株系(K株系), 分别简称T. hyperparasitis (D)、T. hyperparasitis (S)与T. hyperparasitis (K)。
野外采集的宿主鱼首先进行肉眼观察以检查鱼体是否具有明显的病症; 如果为活体样本, 经MS-222麻醉剂安乐死后立即进行解剖镜检, 重点对感染车轮虫的宿主鱼进行鳃涂片, 空干后的鳃涂片采用干银法进行车轮虫附着盘的染色[14]。LEICA DM6000B全自动光学显微镜进行车轮虫附着盘银染标本的显微拍照(1000×)。车轮虫的形态描述及测量依据Lom[15]的统一特定方法进行; 齿体定位图借助软件CorelDRAW X8绘制; 齿体定位描述则依据Van As和Basson[16]倡导、唐发辉等[17]补充的方法进行。重寄生车轮虫的物种鉴定主要结合形态学与分子生物学证据完成。
1.2 附着盘形态量化的差异性分析
基于重寄生车轮虫3株系的附着盘结构的形态学测量数据, 利用SPSS Statistics进行附着盘的形态量化比较分析, 具体参照唐发辉等[18]提出的方法进行, 重点开展单因素方差分析(ANOVA)。同时采用Past3软件对11项附着盘形态学特征(虫体直径、附着盘直径、缘膜宽、齿环直径、齿体纵长、齿长、齿钩长、齿锥宽、齿棘长、齿体数及辐线数)进行了主成分分析(PCA)。
1.3 DNA提取、扩增、克隆与测序
对于重寄生车轮虫每个株系的样本, 于Nikon SMZ1500显微操作系统下使用玻璃微吸管吸取1—2只虫体, 无菌水洗涤纯化后, 采用Sigma试剂盒(REDExtract-N-AmpTM Tissue PCR Kit)进行基因组DNA的提取, 并将成功提取的基因组DNA置于−20℃冰箱保存备用。SSU rDNA扩增的上下游引物分别为82F (5′-GAAACTGGGAATGGCTC-3′)和LSUR (5′-GTTAGTTTCTTTTCCTCCGC-3′), PCR反应程序参照相关文献[19, 20]设定。所获PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测, 并将带有目的片段的PCR产物采用DNA凝胶回收试剂盒(Omega Bio-Tek, Norcross City, GA)进行纯化回收, 然后再将回收产物与pMD18-T载体(TaKaRa, Japan)联结后进行单克隆培养, 成功克隆的每个样本选送3个克隆子送至英潍捷基(上海) 贸易有限公司测序, 测序结果完全一致后方可使用。
1.4 序列来源与分析
本研究新获得重寄生车轮虫3株系(S株系、D株系与K株系)各1条SSU rDNA序列, 其序列长度分别为1838、1903和1833 nt, 提交GenBank后获得序列登录号分别为PQ145195、PQ149211与PQ149212。基于这3条序列, 使用GenBank的BLAST工具进行序列同源性比对, 根据比对结果, 选取同源性较高的30条游走类纤毛虫的有效序列, 其中包含车轮虫科4属(车轮虫属Trichodina 22条、小车轮虫属Trichodinella 3条、三分虫属Tripartiella 2条、拟车轮虫属Paratrichodina 1条)与壶形虫科1属(壶虫形属Urceolaria 2条)。另外, 选用两种固着类纤毛虫(聚缩虫属Zoothamnium 1条与钟虫属Vorticella 1条)为外群构建系统发育树。
通过 Clustal W 程序按照默认参数进行序列多重比对, 序列相似度采用在线比对工具 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/)计算完成; 遗传距离基于 K2P 模型并通过软件MEGA 6.0计算完成[21]; SSU rDNA一级结构序列的变异位点分析则采用 Bioedit 软件完成。
1.5 系统发育分析
本研究共计选用35条纤毛虫序列(包括本研究新获得的重寄生车轮虫3个序列)进行贝叶斯树(BI树)与最大似然树(ML树)的构建; 其中BI 树借助MrBayes 3.1.2 软件构建完成, Modeltest 3.7 计算筛选最优进化模型为GTR+I+G, 共运行 10000000 代, 每 200 代抽样 1 次, 在舍弃25% 的老化样本后, 再依据剩余样本构建一致树。ML树则采用在线网站软件CIPRES Science Gateway V.3.1 (htlp://www.phylo.org/sub_sections/portal), 选用 RAxMLHPC2 XSEDE (8.2.12)模式构建完成[22, 23]。最后通过FigTree v1.4.2及Photoshop CS6 软件完成系统发育树的绘制。
2. 结果
2.1 重寄生车轮虫形态学重描述与株系比较
中型淡水车轮虫虫体较高且侧面观似盔状(图 1A和1B)。附着盘中构成齿体的齿钩较发达呈镰刀状, 位于Y到Y+1轴空间中, 齿钩外切缘与缘膜不平行, 骨突略钝且大多数略低于外切缘, 齿钩前后缘光滑近平行, 无明显钩突及后突起; 齿钩连接纤细; 齿锥较发达且嵌合紧密, 齿锥顶点圆钝, 超过1/2YY-1且接近Y-1轴; 齿棘细长略向前倾或紧贴Y轴, 齿棘顶点稍钝并指向附着盘中央, 无明显棘突(图 1C)。
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图 1 重寄生车轮虫银染标本及齿体定位线条图 (比例尺: 20 μm)A. 反口面结构(发育完全个体); B. 口面与反口面结构(发育中个体); C. 齿体定位线条图Figure 1. Silver impregnated specimens and denticle diagrammatic drawing of Trichodina hyperparasitis Chen & Hsieh, 1984 (scale bar: 20 μm)A. aboral structure (developed individual); B. oral and aboral structures (developing individual); C. denticle diagrammatic drawing关于重寄生车轮虫不同株系的采集信息及形态测量数据比较具体见表 1, 其中采集信息所涉及的感染强度的具体划分标准界定: 光镜下放大10×10倍后1个视野内平均虫体数为1—5为轻度; 虫体数6—10为中度; 虫体数>10为重度。
表 1 重寄生车轮虫不同株系的采集信息及形态测量数据比较Table 1. Morphometric comparison for strains of T. hyperparasitis指标Index 重寄生车轮虫 T. hyperparasitis D株系D strain K株系K strain S株系S strain 原始株系Original strain 宿主Host 乌鳢Channa argus 月鳢Channa asiatica 乌鳢Channa argus 乌鳢鳃上中华狭腹蚤
Lampraglena chinensis采集地Locality 重庆大足 贵州凯里 重庆沙坪坝 湖北武汉 采集时间Sample time 2019年 2020年 2024年 1984年 采集部位Location 鳃 鳃 鳃 体表(乌鳢鳃) 感染率Prevalence 66.67% (6/9) 58.3% (7/12) 100% (3/3) 75% (9/12) 感染强度Intensity 中度 中度 轻度 / 虫体直径
Body diameter31.21—54.06 μm
(44.12±5.79)38.39—49.72 μm
(44.5±3.32)35.60—59.40 μm
(50.61±5.91)44.4—58.9 μm (50.2) 附着盘直径
Adhesive disc25.01—44.75 μm
(36.89±6.33)29.40—41.16 μm
(35.79±3.21)28.80—51.80 μm
(42.48±5.79)36.0—48.0 μm (42.8) 齿环直径
Denticular ring16.19—26.63 μm
(22.87±4.00)17.88—24.86 μm
(21.83±1.74)16.20—30.60 μm
(25.67±3.77)18.2—22.8 μm (20.2) 缘膜宽
Border membrane2.62—4.16 μm
(3.61±0.47)3.82—4.72 μm
(34.34±0.26)3.40—5.50 μm
(4.25±0.49)/ 齿体数Denticle number 20—25 20—23 21—25 22—26 辐线数Radial pins 7 7—8 8 7—8 齿体纵长
Denticle span8.95—14.97 μm
(11.91±1.88)9.39—13.13 μm
(11.91±0.99)9.50—15.60 μm
(13.20±1.54)/ 齿长
Denticle length4.42—6.30 μm
(5.87±0.82)4.18—6.24 μm
(5.20±0.75)4.10—7.90 μm
(6.84±0.99)/ 齿钩长
Blade length3.35—4.79 μm
(4.04±0.40)3.89—6.20 μm
(4.78±0.61)3.70—6.40 μm
(5.24±0.68)4.8—6.0 μm (5.4) 齿锥宽
Central part width1.12—2.07 μm
(1.82±0.35)1.41—3.43 μm
(2.29±0.59)1.70—2.80 μm
(2.31±0.35)/ 齿棘长
Ray length4.04—6.98 μm
(5.36±0.98)3.45—6.04 μm
(4.78±0.79)3.10—7.10 μm
(5.65±1.00)3.6—7.2 μm (5.7) 口围绕度
Adoral ciliary spiral400° 400° 400° 400° 数据来源Resource 本研究 本研究 本研究 Chen & Hsieh (1984) 注: 本研究的数据统计模式为最小值-最大值(平均值±标准差); “/”无描述或无数据Note: The statistic mode of present study is mix-max (mean±SD); “/”. No description or data 2.2 重寄生车轮虫附着盘形态量化差异分析
根据附着盘形态结构多重比较结果(表 2): S株系同时与D、K两株系在虫体直径与附着盘直径方面存在显著差异(P<0.05), 说明S株系显著大于二者; 就齿环直径而言, 仅S株系与K株系间存在显著差异(P<0.05), 说明S株系显著大于K株系; 就缘膜宽而言, D株系与两个株系(S株系与K株系)存在显著差异(P<0.05), 说明D株系显著小于其他两株系; 在齿体纵长方面, S株系也同时与D、K两株系间存在显著差异(P<0.05), 说明S株系显著长于后两者; 就齿体数而言, K株系显著少于其他二者(P<0.05)。
表 2 重寄生车轮虫不同株系附着盘形态结构多重比较Table 2. Multiple comparison of morphological structure in different stains of T. hyperparasitis分析类别Categories I 株系Strain J 株系Strain 均值差 (I—J)
Mean difference显著性P 95% 置信区间95% confidence interval 下限Lower limit 上限Upper limit 虫体直径Body diameter D株系 K株系 –0.382 0.853 –4.520 3.757 S株系 –6.491* 0.002 –10.457 –2.525 K株系 D株系 0.382 0.853 –3.757 4.520 S株系 –6.109* 0.001 –9.653 –2.565 S株系 D株系 6.491* 0.002 2.525 10.457 K株系 6.109* 0.001 2.565 9.653 附着盘直径Adhesive disc D株系 K株系 1.097 0.601 –3.096 5.290 S株系 –5.594* 0.007 –9.612 –1.575 K株系 D株系 –1.097 0.601 –5.290 3.096 S株系 –6.690* 0.001 –10.28 –3.100 S株系 D株系 5.594* 0.007 1.575 9.612 K株系 6.690* 0.001 3.100 10.281 齿环直径Denticular ring D株系 K株系 1.047 0.834 –2.649 4.743 S株系 –2.801 0.225 –6.783 1.182 K株系 D株系 –1.047 0.834 –4.743 2.649 S株系 –3.847* 0.001 –6.272 –1.423 S株系 D株系 2.801 0.225 –1.182 6.783 K株系 3.847* 0.001 1.423 6.272 缘膜宽Border membrane D株系 K株系 –0.736* 0.000 –1.070 –0.401 S株系 –0.642* 0.000 –0.962 –0.321 K株系 D株系 0.736* 0.000 0.401 1.070 S株系 0.094 0.513 –0.193 0.380 S株系 D株系 0.642* 0.000 0.321 0.962 K株系 –0.094 0.513 –0.380 0.193 齿体纵长Denticle span D株系 K株系 0.003 0.997 –1.185 1.190 S株系 –1.293* 0.027 –2.431 –0.155 K株系 D株系 –0.003 0.997 –1.190 1.185 S株系 –1.295* 0.014 –2.313 –0.278 S株系 D株系 1.293* 0.027 0.155 2.431 K株系 1.295* 0.014 0.278 2.313 齿体数Denticle number D株系 K株系 1.688* 0.003 0.614 2.761 S株系 0.724 0.169 –0.321 1.768 K株系 D株系 –1.688* 0.003 –2.761 –0.614 S株系 –0.964* 0.026 –1.805 –0.123 S株系 D株系 –0.724 0.169 –1.768 0.321 K株系 0.964* 0.026 0.123 1.805 注: *. 均值差的显著性水平为 0.05Note: *. the significance level of mean difference is 0.05 附着盘形态结构比值的统计分析结果显示(表 3): S株系与K株系在两大比值, 即齿环直径/虫体直径(dd/db) 与齿长/齿体纵长(l/s)方面均存在显著差异(P<0.05), D株系与K株系则在齿长/齿体纵长(l/s)与齿钩长/齿体纵长(b/s)方面均存在显著差异(P<0.05)。
表 3 重寄生车轮虫不同株系附着盘形态结构比值多重比较Table 3. Multiple comparison of adhesive disc ratio for different stain of T. hyperparasitis分析类别Categories I 株系
StrainJ 株系
Strain样本均值差及显著性检验
Mean difference and significance test95%置信区间
95% confidence interval均值差(I—J) Mean difference P 下限Lower limit 上限Upper limit 齿环直径/虫体直径(dd/db) D株系 K株系 0.029 0.402 –0.025 0.082 S株系 –0.005 0.990 –0.059 0.049 K株系 D株系 –0.029 0.402 –0.082 0.025 S株系 –0.034* 0.000 –0.053 –0.016 S株系 D株系 0.005 0.990 –0.049 0.059 K株系 0.034* 0.000 0.016 0.053 齿长/齿体纵长(l/s) D株系 K株系 0.060* 0.005 0.019 0.101 S株系 –0.021 0.295 –0.060 0.019 K株系 D株系 –0.060* 0.005 –0.101 –0.019 S株系 –0.081* 0.000 –0.116 –0.045 S株系 D株系 0.021 0.295 –0.019 0.060 K株系 0.080* 0.000 0.045 0.116 齿钩长/齿体纵长(b/s) D株系 K株系 –0.058* 0.000 –0.084 –0.032 S株系 –0.053* 0.000 –0.078 –0.028 K株系 D株系 0.058* 0.000 0.032 0.084 S株系 0.005 0.664 –0.018 0.027 S株系 D株系 0.053* 0.000 0.028 0.078 K株系 –0.005 0.664 –0.027 0.018 注: *. 均值差的显著性水平为0.05Note: *. the significance level of mean difference is 0.05 基于附着盘结构的主成分分析(PCA)结果(图 2): 3株系的散点图均不同程度相互重叠, 但相较而言, S株系与K株系重叠最少, 以此说明在3株中, S株系与K株系间差异最大。
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图 2 重寄生车轮虫3株系主成分分析Figure 2. Principal component analysis (PCA) of three strains of T. hyperparasitis2.3 重寄生车轮虫SSU rDNA的分子特征
基于重寄生车轮虫3株系的SSU rDNA一级结构的序列比对结果: 以S株系序列(1832 nt)为参照模板, K株系较之有10个碱基变异位点(5个转换位点, 4个颠换位点, 1个插入位点), D株系较之则仅存在2个颠换变异位点。
基于SSU rDNA的遗传距离与序列相似度分析结果(表 4), 本研究中的重寄生车轮虫3株系间的序列相似度在99.45%—100%, 遗传距离 0.001—0.003。当其与GenBank中序列相似度最高的几种近缘车轮虫, 即马氏车轮虫Trichodina matsu Basson & Van As, 1994, 桑瓦拉车轮虫Trichodina sangwala Van As & Basson, 1992, 以及GenBank中登录号为KX904933的同名“重寄生车轮虫”进行比较时, 其序列相似度在97.0%—98.2%, 遗传距离为0.017—0.019。值得注意的是, 登录号为KX904933的所谓“重寄生车轮虫”与本研究中重寄生车轮虫各株系间的序列相似度在98.0%—98.2%, 遗传距离在0.017—0.018, 却与登录号为MN072368的马氏车轮虫序列相似度高达99.81%, 遗传距离为 0.001。
表 4 基于SSU rDNA的重寄生车轮虫各株系及与近缘物种间的序列相似度(右上)与遗传距离(左下)Table 4. Similarities (upper right diagonal) and genetic distances (lower left diagonal) for strains of T. hyperparasitis with the closely trichodinids based on SSU rDNA sequences编号
Number车轮虫种名
Trichodinid species登录号
Accession编号 Number 1 2 3 4 5 6 1 T. hyperparasitis (S) PQ145195 99.84% 99.45% 97.28% 98.15% 97.27% 2 T. hyperparasitis (D) PQ149211 0.001 99.45% 97.20% 98.09% 97.21% 3 T. hyperparasitis (K) PQ149212 0.003 0.003 97.16% 98.15% 97.20% 4 T. matsu MN072368 0.017 0.017 0.017 99.81% 98.52% 5 T. Hyperparasitis KX904933 0.017 0.017 0.018 0.001 98.82% 6 T. sangwala ON042771 0.019 0.019 0.019 0.010 0.011 2.4 系统发育分析
本研究基于SSU rDNA为分子标记构建的BI树和ML树呈现出完全一致的拓扑结构。系统发育分析结果显示(图 3): 本研究中涉及的重寄生车轮虫3株系聚为一支, 其中S株系与D株系先聚支, 然后再与K株系共同形成一大支。另外, 马氏车轮虫T. matsu (宿主为黄颡鱼Tachysurus fulvidraco)与登录号为KX904933的“重寄生车轮虫”(宿主同为黄颡鱼T. fulvidraco)先聚支, 然后再与桑瓦拉车轮虫T. sangwala (宿主为鲇Silurus asotus)聚成一大支, 该大支与包含重寄生车轮虫三株系的大枝形成姊妹支, 并且该姊妹支正是按宿主鱼类(鲈形目Perciformes与鲇形目Siluriformes)分别进行聚支。
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图 3 基于SSU rDNA 序列构建的BI/ML 系统发育树节点处数值分别为BI树和ML树的支持率Figure 3. BI/ML Phylogenetic tree based on SSU rDNA sequences of T. hyperparasitis with the related speciesSupport values at branching points are listed as Bayesian posterior probabilities/bootstrap values from maximum likelihood analysis3. 讨论
3.1 重寄生车轮虫宿主偏好性及种类厘定
正如前言所述, 重寄生车轮虫最早发现寄生于乌鳢(C. argus)鳃上的中华狭腹鳋(L. chinensis), 属于双重寄生, 故命名为重寄生车轮虫[10]。但自此之后, 有关该虫种的所有报道均来自乌鳢鳃表[11—13], 且从未发现乌鳢鳃上同时有中华狭腹鳋寄生。本研究通过广泛采样, 从重庆、贵州两地检获的3株系, 无论在虫体大小、附着盘形态结构及其量度方面, 均与原始种群基本一致(表 1), 3株系中的2株系(重庆S株系与D株系)均为乌鳢鳃寄生, 另一株系(贵州K株系)则首次从另一宿主—月鳢(C. asiatica)鳃上获取, 同样3株系均未见鳋类的寄生。因此结合前期报道数据, 本研究进一步支持了重寄生车轮虫并非必须营“重寄生”生活。此外, 乌鳢与月鳢同为鳢属(Channa)鱼类, 二者生活习性相近, 加上在水产养殖中可将二者混养[24], 因此这可能为重寄生车轮虫在不同宿主间的传播提供了条件。由于迄今所有关于该种的报道毫无例外地均在乌鳢鳃上发现, 此次的月鳢寄生为首次报道, 故月鳢为重寄生车轮虫的宿主新记录, 贵州为地区新记录。综合当前已有研究推测, 重寄生车轮虫不仅寄生于乌鳢, 也可寄生月鳢, 而二者为鳢属近缘种[25], 因此推测在宿主寄生特异性方面, 该虫更偏好寄生于鳢属鱼类。当然, 当宿主鱼类被其他类群的大型寄生虫, 如中华狭腹鳋寄生时, 它们亦可在这些寄生虫身上临时附着, 亦或产生对狭腹鳋的偶然寄生? 但这种关系需要更多的研究证据加以验证或揭示。
基于分子数据研究结果发现, 尽管本研究的重寄生车轮虫3株系来自不同的地区(重庆或贵州)或宿主(乌鳢或月鳢), 但3株系间的SSU rDNA序列相似度却在99.45%—100%, 遗传距离在 0.001—0.003 (表 4)。已有研究表明, SSU rDNA可以作为原生动物种间或种内鉴定的有效分子标记[26], 并且基于以SSU rDNA为分子标记的寄生虫的相关研究认为, 序列相似度在99.0%—100%, 且遗传距离在0.001—0.005均属于种内水平[27—29], 因此从分子水平进一步证明了本研究的3株系为同一物种。但值得关注的一个问题出现了, GenBank中已有1条以“重寄生车轮虫”命名上传的SSU rDNA序列(登录号KX904933), 但其与本研究中的重寄生车轮虫3株系的序列相似度仅98.0%—98.2%, 遗传距离为 0.017—0.019。反之却与登录号为MN072368的马氏车轮虫序列相似度却高达99.81%, 遗传距离为0.001 (表 4)。这说明KX904933的“重寄生车轮虫”与本研究中的重寄生车轮虫属于种间水平, 而与MN072368的马氏车轮虫则属于种内水平。进一步通过分子系统树的聚支情况查证, KX904933的“重寄生车轮虫”并未和本研究中的重寄生车轮虫先聚支, 而是先和马氏车轮虫聚支, 再与桑瓦拉车轮虫T. sangwalab聚为大支, 最后与本研究的重寄生车轮虫支系形成姊妹支(图 3)。基于该情况, 本文进一步追溯了KX904933的“重寄生车轮虫”的原始报道数据后发现, 该虫的形态结构与马氏车轮虫高度相似, 且其宿主也与马氏车轮虫的宿主相同, 均为鲇形目的黄颡鱼(并非乌鳢)[30]。相关研究表明, 部分车轮虫表现出明显的宿主专一性或偏好性。一般认为, 马氏车轮虫是鲇形目鱼类的专性寄生虫[31], 刺纹车轮虫则偏好寄生于鲈形目的广盐性罗非鱼[32]。因此本研究基于序列相似度、遗传距离、系统发育与宿主类型等证据进一步证明了登录号为KX904933的“重寄生车轮虫”并非真正的重寄生车轮虫, 而应为马氏车轮虫的观点[31]。综上, 本研究为首次向GenBank提供了真实有效的重寄生车轮虫分子数据。
3.2 重寄生车轮虫的种内分化
附着盘形态结构量化分析表明(表 2), 三大株系在虫体大小及齿体数量方面存在显著差异, 其中S株系是最大的株系(P<0.05), 也是齿体最长的株系(P<0.05); D株系是虫体最小且缘膜最窄的株系(P<0.05), K株系是齿体数最少的株系(P<0.05)。进一步将附着盘结构比值化处理, 以将量化的结构差异转化为形态化差异, 其分析结果显示(表 3), 由于S株系与K株系在齿环直径/虫体直径(dd/db)与齿长/齿体纵长(l/s)两方面均存在显著差异(P<0.05)。而dd/db比值可反映车轮虫齿体构成的齿环在附着盘中的位置, 故表明S株系与K株系在附着盘整体结构上存在差异; 同时l/s比值可反映每个独立齿体的纵横比例, 故能间接揭示齿体的整体形态, 因此, l/s比值的显著差异揭示了S株系与K株系在齿体形态方面也存在一定的种内差异。此外, PCA的分析结果也进一步支持了S株系与K株系间差异的存在(图 2)。
基于分子证据显示, S株系与K株系间存在10个碱基变异位点, 而与D株系间则仅存在2个变异位点; 并且S株系与K株系的遗传距离大于与D株系的遗传距离(0.003 vs. 0.001), 而序列相似度却小于后者(99.45% vs. 99.84%); 同时结合系统树的聚支情况, S株系与D株系先聚支, 然后再与K株系共同形成一大支(图 3)。该结果共同表明了S株系与D株系间更近缘, 而二者与K株系间则较远缘。
综合形态与分子证据表明, 重寄生车轮虫3株系存在一定的遗传分化与形态分化, 贵州地区月鳢寄生的K株系与重庆地区乌鳢寄生的两株系(S株系与D株系)具有较远的亲缘关系, 说明地理分布与宿主的差异与株系的分化密切相关。相关研究认为, 作为影响寄生虫进化的各类因素中, 地理分布与宿主类型等均可不同程度地影响虫体的种间或种内进化[33—35], 如地理隔离被认为是蛇鲭库道虫种群分化的主要影响因素[36], 而宿主的差异则被认为是影响眉溪小车轮虫种内分化的主要因素[37]。因此, 进一步结合本研究中系统发育树的聚支结果(图 3), 重寄生车轮虫与近缘种之间形成了宿主种类特有的单系, 即“鲈形目Perciformes支系”与“鲇形目Siluriformes支系”两支; 同时在重寄生车轮虫种内也形成了宿主种群特有的单系, 即“乌鳢支系”与“月鳢支系”, 推测对于外寄生的车轮虫而言, 第一生境即宿主的类型可能是影响车轮虫种间或种群分化最直接的因素。
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图 1 重寄生车轮虫银染标本及齿体定位线条图 (比例尺: 20 μm)
A. 反口面结构(发育完全个体); B. 口面与反口面结构(发育中个体); C. 齿体定位线条图
Figure 1. Silver impregnated specimens and denticle diagrammatic drawing of Trichodina hyperparasitis Chen & Hsieh, 1984 (scale bar: 20 μm)
A. aboral structure (developed individual); B. oral and aboral structures (developing individual); C. denticle diagrammatic drawing
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图 2 重寄生车轮虫3株系主成分分析
Figure 2. Principal component analysis (PCA) of three strains of T. hyperparasitis
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图 3 基于SSU rDNA 序列构建的BI/ML 系统发育树
节点处数值分别为BI树和ML树的支持率
Figure 3. BI/ML Phylogenetic tree based on SSU rDNA sequences of T. hyperparasitis with the related species
Support values at branching points are listed as Bayesian posterior probabilities/bootstrap values from maximum likelihood analysis
表 1 重寄生车轮虫不同株系的采集信息及形态测量数据比较
Table 1 Morphometric comparison for strains of T. hyperparasitis
指标Index 重寄生车轮虫 T. hyperparasitis D株系D strain K株系K strain S株系S strain 原始株系Original strain 宿主Host 乌鳢Channa argus 月鳢Channa asiatica 乌鳢Channa argus 乌鳢鳃上中华狭腹蚤
Lampraglena chinensis采集地Locality 重庆大足 贵州凯里 重庆沙坪坝 湖北武汉 采集时间Sample time 2019年 2020年 2024年 1984年 采集部位Location 鳃 鳃 鳃 体表(乌鳢鳃) 感染率Prevalence 66.67% (6/9) 58.3% (7/12) 100% (3/3) 75% (9/12) 感染强度Intensity 中度 中度 轻度 / 虫体直径
Body diameter31.21—54.06 μm
(44.12±5.79)38.39—49.72 μm
(44.5±3.32)35.60—59.40 μm
(50.61±5.91)44.4—58.9 μm (50.2) 附着盘直径
Adhesive disc25.01—44.75 μm
(36.89±6.33)29.40—41.16 μm
(35.79±3.21)28.80—51.80 μm
(42.48±5.79)36.0—48.0 μm (42.8) 齿环直径
Denticular ring16.19—26.63 μm
(22.87±4.00)17.88—24.86 μm
(21.83±1.74)16.20—30.60 μm
(25.67±3.77)18.2—22.8 μm (20.2) 缘膜宽
Border membrane2.62—4.16 μm
(3.61±0.47)3.82—4.72 μm
(34.34±0.26)3.40—5.50 μm
(4.25±0.49)/ 齿体数Denticle number 20—25 20—23 21—25 22—26 辐线数Radial pins 7 7—8 8 7—8 齿体纵长
Denticle span8.95—14.97 μm
(11.91±1.88)9.39—13.13 μm
(11.91±0.99)9.50—15.60 μm
(13.20±1.54)/ 齿长
Denticle length4.42—6.30 μm
(5.87±0.82)4.18—6.24 μm
(5.20±0.75)4.10—7.90 μm
(6.84±0.99)/ 齿钩长
Blade length3.35—4.79 μm
(4.04±0.40)3.89—6.20 μm
(4.78±0.61)3.70—6.40 μm
(5.24±0.68)4.8—6.0 μm (5.4) 齿锥宽
Central part width1.12—2.07 μm
(1.82±0.35)1.41—3.43 μm
(2.29±0.59)1.70—2.80 μm
(2.31±0.35)/ 齿棘长
Ray length4.04—6.98 μm
(5.36±0.98)3.45—6.04 μm
(4.78±0.79)3.10—7.10 μm
(5.65±1.00)3.6—7.2 μm (5.7) 口围绕度
Adoral ciliary spiral400° 400° 400° 400° 数据来源Resource 本研究 本研究 本研究 Chen & Hsieh (1984) 注: 本研究的数据统计模式为最小值-最大值(平均值±标准差); “/”无描述或无数据Note: The statistic mode of present study is mix-max (mean±SD); “/”. No description or data 
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表 2 重寄生车轮虫不同株系附着盘形态结构多重比较
Table 2 Multiple comparison of morphological structure in different stains of T. hyperparasitis
分析类别Categories I 株系Strain J 株系Strain 均值差 (I—J)
Mean difference显著性P 95% 置信区间95% confidence interval 下限Lower limit 上限Upper limit 虫体直径Body diameter D株系 K株系 –0.382 0.853 –4.520 3.757 S株系 –6.491* 0.002 –10.457 –2.525 K株系 D株系 0.382 0.853 –3.757 4.520 S株系 –6.109* 0.001 –9.653 –2.565 S株系 D株系 6.491* 0.002 2.525 10.457 K株系 6.109* 0.001 2.565 9.653 附着盘直径Adhesive disc D株系 K株系 1.097 0.601 –3.096 5.290 S株系 –5.594* 0.007 –9.612 –1.575 K株系 D株系 –1.097 0.601 –5.290 3.096 S株系 –6.690* 0.001 –10.28 –3.100 S株系 D株系 5.594* 0.007 1.575 9.612 K株系 6.690* 0.001 3.100 10.281 齿环直径Denticular ring D株系 K株系 1.047 0.834 –2.649 4.743 S株系 –2.801 0.225 –6.783 1.182 K株系 D株系 –1.047 0.834 –4.743 2.649 S株系 –3.847* 0.001 –6.272 –1.423 S株系 D株系 2.801 0.225 –1.182 6.783 K株系 3.847* 0.001 1.423 6.272 缘膜宽Border membrane D株系 K株系 –0.736* 0.000 –1.070 –0.401 S株系 –0.642* 0.000 –0.962 –0.321 K株系 D株系 0.736* 0.000 0.401 1.070 S株系 0.094 0.513 –0.193 0.380 S株系 D株系 0.642* 0.000 0.321 0.962 K株系 –0.094 0.513 –0.380 0.193 齿体纵长Denticle span D株系 K株系 0.003 0.997 –1.185 1.190 S株系 –1.293* 0.027 –2.431 –0.155 K株系 D株系 –0.003 0.997 –1.190 1.185 S株系 –1.295* 0.014 –2.313 –0.278 S株系 D株系 1.293* 0.027 0.155 2.431 K株系 1.295* 0.014 0.278 2.313 齿体数Denticle number D株系 K株系 1.688* 0.003 0.614 2.761 S株系 0.724 0.169 –0.321 1.768 K株系 D株系 –1.688* 0.003 –2.761 –0.614 S株系 –0.964* 0.026 –1.805 –0.123 S株系 D株系 –0.724 0.169 –1.768 0.321 K株系 0.964* 0.026 0.123 1.805 注: *. 均值差的显著性水平为 0.05Note: *. the significance level of mean difference is 0.05
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表 3 重寄生车轮虫不同株系附着盘形态结构比值多重比较
Table 3 Multiple comparison of adhesive disc ratio for different stain of T. hyperparasitis
分析类别Categories I 株系
StrainJ 株系
Strain样本均值差及显著性检验
Mean difference and significance test95%置信区间
95% confidence interval均值差(I—J) Mean difference P 下限Lower limit 上限Upper limit 齿环直径/虫体直径(dd/db) D株系 K株系 0.029 0.402 –0.025 0.082 S株系 –0.005 0.990 –0.059 0.049 K株系 D株系 –0.029 0.402 –0.082 0.025 S株系 –0.034* 0.000 –0.053 –0.016 S株系 D株系 0.005 0.990 –0.049 0.059 K株系 0.034* 0.000 0.016 0.053 齿长/齿体纵长(l/s) D株系 K株系 0.060* 0.005 0.019 0.101 S株系 –0.021 0.295 –0.060 0.019 K株系 D株系 –0.060* 0.005 –0.101 –0.019 S株系 –0.081* 0.000 –0.116 –0.045 S株系 D株系 0.021 0.295 –0.019 0.060 K株系 0.080* 0.000 0.045 0.116 齿钩长/齿体纵长(b/s) D株系 K株系 –0.058* 0.000 –0.084 –0.032 S株系 –0.053* 0.000 –0.078 –0.028 K株系 D株系 0.058* 0.000 0.032 0.084 S株系 0.005 0.664 –0.018 0.027 S株系 D株系 0.053* 0.000 0.028 0.078 K株系 –0.005 0.664 –0.027 0.018 注: *. 均值差的显著性水平为0.05Note: *. the significance level of mean difference is 0.05
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表 4 基于SSU rDNA的重寄生车轮虫各株系及与近缘物种间的序列相似度(右上)与遗传距离(左下)
Table 4 Similarities (upper right diagonal) and genetic distances (lower left diagonal) for strains of T. hyperparasitis with the closely trichodinids based on SSU rDNA sequences
编号
Number车轮虫种名
Trichodinid species登录号
Accession编号 Number 1 2 3 4 5 6 1 T. hyperparasitis (S) PQ145195 99.84% 99.45% 97.28% 98.15% 97.27% 2 T. hyperparasitis (D) PQ149211 0.001 99.45% 97.20% 98.09% 97.21% 3 T. hyperparasitis (K) PQ149212 0.003 0.003 97.16% 98.15% 97.20% 4 T. matsu MN072368 0.017 0.017 0.017 99.81% 98.52% 5 T. Hyperparasitis KX904933 0.017 0.017 0.018 0.001 98.82% 6 T. sangwala ON042771 0.019 0.019 0.019 0.010 0.011
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