GENOME-WIDE ANALYSIS OF THE TRIPLOPHYSA PAPPENHEIMI HEMOGLOBIN GENE FAMILY AND ITS RESPONSE TO HYPOXIA STRESS
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摘要:
为探究血红蛋白基因家族在黄河高原鳅(Triplophysa pappenheimi)低氧适应中的作用, 研究基于黄河高原鳅基因组数据对血红蛋白基因家族进行了生物信息学分析, 并开展低氧胁迫和基因表达检测。结果显示, 黄河高原鳅血红蛋白基因家族由11个成员组成, 其中包括6个α珠蛋白基因(hbaa1、hbaa2、hbae1、hbae3、hbae4和hbae5)和5个β珠蛋白基因(hbba1、hbba2、hbbe1.1、hbbe1.2和hbbe2)。Motif、Domain 及基因结构分析结果均表明该家族成员具有较高的保守性, 除hbbe2外, 其余基因结构相似。染色体定位分析结果显示, 血红蛋白基因家族成员分布在2条染色体上(Chr_07、Chr_17)。蛋白理化性质分析结果显示, 除hbbe1.2为疏水性不稳定蛋白, 其余基因产物均为疏水性稳定蛋白, 其中hbae3、hbbe1.1、hbbe2为酸性蛋白; 其余8个为碱性蛋白, 其中α-螺旋是主要的二级结构。亚细胞定位预测结果显示, 除hbae4基因产物位于细胞质中, hbae3位于细胞质和细胞外; 其余血红蛋白基因均位于线粒体中。基因表达研究表明, 在急性低氧胁迫12h (0.3±0.1 mg/L)后, hbaa1、hbaa2、hbba1和hbba2基因在肝脏、鳃和血液中的表达量具有上调趋势, 但是差异不显著(P<0.05); 在慢性低氧24h至96h [(3.0±0.1) mg/L]时, hbaa1、hbba1、hbaa2和hbba2基因在肝脏和血液中的表达量达到峰值(P<0.05), 随着胁迫时间延长, 上述基因的表达量均有所下调。在鳃组织中, hbaa1、hbaa2和hbba1的最高表达量出现在慢性低氧后的196h, 而hbba2基因表达峰值出现在24h。研究展示了黄河高原鳅血红蛋白基因家族成员的低氧胁迫表达模式, 为黄河高原鳅的低氧适应机制研究积累科学数据。
Abstract:Triplophysa pappenheimi is a representative species of Nemacheilinae, which can adapt to the aquatic environment of Tibetan Plateau. To investigate the role of hemoglobin gene family in T. pappenheimi adaptation to hypoxia, bioinformatics analysis of hemoglobin gene family was performed based on genome data, followed by an examination of expression changes of hemoglobin genes in response to hypoxia. The hemoglobin gene family to T. pappenheimi consists of 11 members, including six α-globin genes (hbaa1, hbaa2, hbae1, hbae3, hbae4, and hbae5) and five β-globin genes (hbba1, hbba2, hbbe1.1, hbbe1.2, and hbbe2). Motif, domain, and gene structure analysis showed high conservation among these genes; with the exception of hbbe2, the others exhibited similar structure features. Chromosomal localization analysis showed that the members of hemoglobin gene family were distributed on two chromosomes (Chr_07 and Chr_17). The results of physicochemical analysis indicated that all the gene products were stable hydrophobic proteins, except hbbe1.2, among which, hbae3, hbbe1.1, and hbbe2 were classified as acidic proteins, and the other eight were basic proteins, with α-helix is the main secondary structure. Subcellular localization prediction showed that hbae3 and hbae4 were located in the cytoplasm and the other hemoglobin genes were found in the mitochondria. The expression of hbaa1, hbaa2, hbba1 and hbba2 genes in liver, gill and blood showed an up-regulated trend after 12h of acute hypoxia stress, though the difference was not significant (P<0.05). The expression levels of hbaa1, hbba1, hbaa2, and hbba2 genes in liver and blood reached the peak at 24 h to 96h under chronic hypoxia (P<0.05). In gill tissue, the highest expression of hbaa1, hbaa2, and hbba1 appeared at 196h after chronic hypoxia, while hbba2 reached its peak at 24h. This study reveals the role of the hemoglobin gene family in hypoxic environment of T. pappenheimi, accumulating valuable scientific data for its conservation.
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高原鳅属(Triplophysa)隶属于鲤形目(Cypriniformes)条鳅科(Nemacheilinae), 是适应于高原特殊水生态环境的主要鱼类群体[1]。黄河高原鳅(Triplophysa pappenheimi)是高原鳅属中底栖小型鱼类, 主要分布在兰州以上黄河上游的干支流激流河段及其附属湖泊, 是适应于青藏高原季节性寒冷环境的代表性鱼类种群之一[2]。目前, 黄河高原鳅已被列入《中国脊椎动物红色名录》, 属于濒危鱼类(Endangered, EN)[3]。
血红蛋白(Hemoglobin, Hb), 作为一种关键的氧转运金属蛋白, 存在于几乎所有脊椎动物(除南极冰鱼科)及一些无脊椎动物组织中[4]。肺、鳃中的氧气被血液中的血红蛋白运输至体内各组织, 再将各组织中的二氧化碳转运出体外, 从而为生物的新陈代谢提供能量。血红蛋白由4个珠蛋白亚基构成, 每个亚基都具备与一个氧分子结合的能力, 血红蛋白最多可携带4个氧分子。平均每克血红蛋白可结合1.34 mL的氧气, 是血浆溶氧量的70倍[5]。在一些无脊椎动物[6]、植物[7]和真菌[8]中也发现了血红蛋白及类血红蛋白分子。因此, 无论是在动物、植物还是微生物中, 血红蛋白都发挥着重要的生理作用。斑马鱼拥有多个血红蛋白基因, 可分为α和β亚型。α亚型包括hbae4、hbae5、hbaa2、hbaa1、hbae1和hbae3; β亚型包括hbbe3、hbba2、hbba1和hbbe1[9]。hbae1、hbae3、hbae4、hbae5、hbbe1和hbbe3基因表达在斑马鱼胚胎期和仔鱼期早期发育阶段, 称为胚胎型血红蛋白基因; 而hbaa1、hbaa2、hbba1和hbba2基因表达在斑马鱼晚期发育阶段(成年个体), 称为成年型血红蛋白。胚胎型血红蛋白和成年型血红蛋白在斑马鱼不同发育阶段分别发挥运输和储存O2的功能[10]。
溶解氧(Dissolved Oxygen, DO)是以分子态溶解在水体中的氧气, 水生生物通过获取DO来进行有氧代谢。水体环境以低氧为特征(只有空气氧分压的1/30), 并呈现出溶氧的时空波动[10—14]。水体缺氧常常会导致鱼类摄食量减少、生长速度减慢、生殖力下降, 甚至引起死亡[15—17]。应对低氧环境, 鱼类在漫长的进化历程中形成了一整套形态、生理和行为等方面的适应策略。鱼类可通过降低基础代谢率减少耗氧量、提高呼吸频率、加速血液循环、浮出水面呼吸、增强血氧亲和力来应对急性低氧环境[18—20]; 而面对时长几天的慢性低氧, 鱼类甚至可能通过改变形态特征, 如增大鳃丝表面积等来提高其适应能力[17, 20, 21]。机体亦可启动分子机制应对低氧环境, 例如, 在长时间低氧环境中, 鱼类糖酵解通路相关基因的表达将显著增强[12], 而一些通过氧依赖性产能相关的基因表达和蛋白翻译将受到限制[20]。通过关键基因的表达调控来帮助鱼类更有效地运输、贮存和利用氧[22, 23]。对于其他分子机制而言, 由血红蛋白基因表达调控介导的低氧应答机制在鱼类低氧适应中发挥着更为直接和重要的作用[24, 25]。
对鱼类低氧适应相关的研究大多数集中于模式生物及经济鱼类如斑马鱼(Danio rerio)、鲤(Cyprinus carpio)和鲫(Carassius auratus)等, 而对高原土著鱼类应对低氧环境的研究鲜有报道。鉴于黄河高原鳅在高原淡水生态系统中的重要地位及对高原环境极强的适应性, 本研究以黄河高原鳅为研究对象, 首先利用基因组数据鉴定其血红蛋白基因家族成员, 并进行生物信息学分析; 然后实施急性和慢性低氧胁迫处理, 检测血红蛋白基因表达模式。目的在于探讨高原土著鱼类低氧适应的生物学过程和分子机制, 为高原土著鱼类生态适应机制、保护生物学等领域的深入研究积累科学数据, 同时为高原鱼类的资源保护、创新利用、人工驯养等方面奠定基础。
1. 材料与方法
1.1 血红蛋白基因家族成员鉴定
以实验室前期测得的黄河高原鳅基因组序列(国家基因库生命大数据平台, ID: CNP0006118)构建本地数据库, 以NCBI中已公布的斑马鱼胚胎型、成年型血红蛋白编码基因hbae1 (NM_182940)、hbae3 (NM_183066)、hbae4 (NM_001082834)、hbae5 (NM_001326701)、hbbe1 (NM_198073)、hbbe2 (NM_212846)、hbbe3 (NM_001015058)、hbaa1 (NM_131257)、hbaa2 (NM_001013461)、hbba1 (NM_131020)、hbba2 (NM_001003431) 的CDS序列为搜索条件, 通过TBtools软件[26](E值设置为≤0.001)进行blast比对, 获得黄河高原鳅血红蛋白基因家族成员。为验证通过上述方法是否获得黄河高原鳅血红蛋白基因家族完整库, 利用TBtools软件中的“Simple HMM Search” 再次对黄河高原鳅基因组数据全面搜索珠蛋白基因家族序列, 并鉴定血红蛋白基因序列。通过上述两种方法所获得的基因序列与斑马鱼相应血红蛋白编码序列比对, 通过GT-AG原则确定基因内含子和外显子。使用ClustalX[27]对斑马鱼和黄河高原鳅血红蛋白序列进行比对, 然后使用MEGA11[28]中的邻接法构建进化树, 设置循环数为1000次。
1.2 血红蛋白基因结构、染色体定位和蛋白保守结构域分析
使用在线分析工具ExPASy (https://web.expasy.org/protparam/)进行蛋白理化特征分析和蛋白质三级结构预测; 用在线网站Cell-PLoc 2.0 (http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/euk-multi-2/)预测血红蛋白基因家族的亚细胞定位; 使用MEME (https://meme-suite.org/meme/tools/meme), Select the site distribution设置为6, 基于Motif分析成员序列保守特征; 用NCBI的 Batch CDD (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)基于Domain分析成员结构的保守性, 并用TBtools可视化。使用TBtools进行基因结构和染色体定位分析。
1.3 实验用鱼及低氧胁迫试验
实验用鱼 黄河高原鳅采集于黄河上游支流泽曲河(青海省泽库县), 运送至青海大学后暂养于循环水养殖车间, 水温14—16℃, pH 7.0—8.0左右。随机选择30尾黄河高原鳅用于试验, 实验鱼平均全长(11.20±0.60) cm, 平均体重(47.30±0.53) g。实验前, 将试验用鱼置于水族箱预养3d, 用氧泵维持常氧状态。实验期间禁止投喂饵料。
急慢性低氧胁迫实验 黄河高原鳅急性和慢性低氧处理实验均在自制水族箱(100 L)中开展, 水箱顶部覆盖塑料膜, 通过充氮除氧方法降低水体中溶解氧。维持低氧期间, 利用HQ便携式电化学分析仪(HQ4300, 美国哈希公司)实时监控水体溶解氧情况。
急性低氧处理: 常氧组和处理组各1组, 每组6尾。常氧组用氧泵持续供氧, 溶解氧浓度维持在(8.4±0.1) mg/L (在室温条件下, 持续供氧时水体溶解氧); 处理组水体进行充氮除氧, 溶解氧在1h内从(8.4±0.1) mg/L下降到(0.3±0.1) mg/L (溶解氧降速1.35 mg/10min), 紧接水体溶解氧(0.3±0.1) mg/L维持12h。
慢性低氧处理: 常氧组和处理组各1组。常氧组6尾; 处理组共3组(24h、96h、168h), 每组6尾, 共18尾。处理组水体进行充氮除氧, 溶解氧在1h内从(8.4±0.1) mg/L 1h下降到(3.0±0.1) mg/L (溶解氧降速0.9 mg/10min), 维持168h, 期间24h、96h、168h分别取样, 每次取6尾; 对照组用氧泵维持常氧状态。
在低氧处理结束后, 立刻用MS-222麻醉, 用无菌注射器从尾静脉处采集血样, 解剖取肝脏、腮组织, 分成两份, 1份用于转录组测序, 另1份用于荧光定量PCR, 液氮保存备用。
1.4 血红蛋白基因家族基因的组织表达分析
基于RNA-seq的基因表达分析 将采集的肝脏组织、鳃组织和血液样本送至百迈客生物科技有限公司进行转录组测序, 以log2 (FPKM+1)对转录组数据进行均一化, 并使用TBtools软件绘制热图, 分析各组织Rh基因家族各成员的表达模式。
基于qRT-PCR的基因表达分析 使用TRIzol裂解法提取肝脏、鳃和血液总RNA并用NanoDrop 2000微量分光光度计(赛默飞世尔科技有限公司)检测RNA的浓度及质量。使用Prime ScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒(TaKaRa)反转录得到cDNA。用Primer 6.0设计引物(表 1), 由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。使用实时荧光定量PCR (Quantitative Real-time PCR, qRT-PCR)检测血红蛋白基因家族成员在各组织中的相对表达量, qRT-PCR以 β-actin为内参基因, 使用TB GreenTM Premix Ex TapTMⅡ试剂盒(TaKaRa)在LightCycler®480Ⅱ实时荧光定量PCR仪(罗氏诊断产品(上海)有限公司)上测定Ct值, 每份样品重复3次, 以0样品为对照, 使用2–∆∆Ct方法[29]计算相对表达量。
表 1 用于qRT-PCR 分析的引物序列Table 1. Primer sequences for qRT-PCR analysis基因
Gene序列
Sequence (5′—3′)退火温度
Annealing
temperature (℃)β-actin F GAACCCCAAGGCTAACAGAGAA 56.9 β-actin R AGGCATACAGGGACAGCACA 59.1 hbae1 F TGGTGTTGGTGAAGCTGTTGAGAA 58.8 hbae1 R GCCAGAACGACGAGTATGTTGTGA 59.3 hbae3 F GAGCCAGGAACTTATCCACAGACA 58.7 hbae3 R CCTCAGACCAAGACCTACTTCTCC 58.8 hbae4 F CATTTACGCTGCCACGGGAAGAA 60.4 hbae4 R TGCTGAGGTGTGCCAGTGTAGT 61.2 hbae5 F TCTCACTGGAGCGACCTGACAC 61.7 hbae5 R GGAAGAGCATGGCAATCACAACAAG 59.0 hbbe1.1 F TACAACGCCGCCGCCATCAT 63.2 hbbe1.1 R GAGGAGACCACAACAGCGAGGAA 61.6 hbbe1.2 F TACAACGCCGCCGCCATCAT 63.2 hbbe1.2 R AGAGACCACAACAGCGAGGAACTT 60.5 hbbe2 F ACTCAGCGGTACTTCGGCAGTT 61.3 hbbe2 R GCAGCAATCACGATAGTCAGGCAAT 59.8 hbaa1 F GACAAGGACAAGGCTGCCGTAAG 61.0 hbaa1 R TGAGCGAAGTAGGTCTTGGTCTGAG 60.3 hbaa2 F ACGATCTTGTTGGTGGATTGAGCAA 58.7 hbaa2 R AGCAGATACAGCCGACAGGAACT 60.5 hbba1 F TCCACCTTCGGCAACCTGTCA 61.8 hbba1 R AGCGGACACGACCACAGACA 61.9 hbba2 F GCCTTTACGCCAAACTAAGCAAACT 58.1 hbba2 R GCCACGACGACAGACAGGAATT 60.1 2. 结果
2.1 血红蛋白基因家族成员的鉴定及蛋白理化性质
通过与斑马鱼血红蛋白基因家族成员blast比对, “Simple HMM Search”进行验证, 在黄河高原鳅中共鉴定出11个血红蛋白基因家族成员。以斑马鱼脑红蛋白(NGB)为外群构建的系统进化树显示, 斑马鱼和黄河高原鳅血红蛋白家族分别形成α和β珠蛋白两个族群(图 1)。按照斑马鱼血红蛋白家族的命名法[10], 将黄河高原鳅基因家族11个成员命名为hbaa1、hbaa2、hbae1、hbae3、hbae4、hbae5、hbba1、hbba2、hbbe1.1、hbbe1.2和hbbe2。黄河高原鳅11个血红蛋白基因的编码序列(CDS)长度为426—528 bp, 编码氨基酸长度在141—175个。蛋白理化性质分析显示(表 2), 分子量(Molecular weight)介于15552.07 (hbaa1)—19411.69 Da (hbae3); 蛋白理论等电点(pI)为6.37—9.58, 其中hbae3、hbbe1.1、hbbe3为酸性蛋白, 其余8个为碱性蛋白; 脂溶性指数(Aliphatic index)在 88.98—112.57; 亲水性平均指数(Grand average of hydropathicity)为0.092, 不稳定性指数(Instability index)在9.9—96.87。除hbbe1.2外, 其余蛋白不稳定指数均小于40[30], 说明hbbe1.2为疏水性不稳定蛋白, 其余血红蛋白均为疏水性稳定蛋白。
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图 1 斑马鱼和黄河高原鳅血红蛋白系统进化树Figure 1. Phylogenetic tree of hemoglobin from Danio rerio and Triplophysa pappenheimi based on the protein sequences表 2 黄河高原鳅血红蛋白基因家族成员理化性质Table 2. Physical and chemical properties of hemoglobin gene family members in Triplophysa pappenheimi基因
GeneCDS长度
CDS length
(bp)氨基酸数目
Number of
amino acid分子质量
Molecular
weight (ku)理论等电点
Theoretical
isoelectric point脂溶性指数
Aliphatic
index亲水性平均值
Grand average of
hydropathicity不稳定性指数
Instability
indexhbae1 444 143 15615.17 9.16 103.71 0.064 23.46 hbae3 528 175 19411.69 6.37 112.57 0.245 24.81 hbae4 426 141 15971.74 9.58 94.89 0.040 39.90 hbae5 432 143 15796.51 9.04 101.68 0.121 24.35 hbbe1.1 444 147 16417.94 6.96 96.87 0.083 16.63 hbbe1.2 444 147 16426.95 7.01 96.87 0.085 96.87 hbbe2 444 147 16786.39 6.90 94.22 –0.073 11.10 hbaa1 432 143 15552.07 8.89 99.65 0.129 21.91 hbaa2 432 143 15556.10 9.33 100.98 0.097 16.03 hbba1 444 147 16113.64 7.70 88.98 0.086 20.53 hbba2 444 147 16181.79 8.89 99.52 0.134 9.90 2.2 血红蛋白基因亚细胞定位预测和二三级结构预测
蛋白质二级结构预测结果显示(表 3), 血红蛋白由α-螺旋(Alpha-helix)、β-折叠(Beta-turn)、无规则卷曲(Random coil)和延伸链(Extended strand)4种二级结构元件组成, 其中α-螺旋是主要的二级结构, 占比介于73.47%—58.29%, 无规则卷曲和延伸链在蛋白结构中占比分别在25.87%—14.97%和13.14%—4.76%, 而β-折叠的占比均低于7%。亚细胞定位预测显示, hbae4位于细胞质中, hbae3位于细胞质和细胞外, 其余血红蛋白基因均位于线粒体中。黄河高原鳅血红蛋白三级结构预测显示, 与二级结构预测一致, 血红蛋白主要由α-螺旋组成(图 2)。
表 3 黄河高原鳅血红蛋白基因家族成员二级结构和亚细胞定位Table 3. Secondary structure and subcellular localization of hemoglobin gene family members in Triplophysa pappenheimi基因
Geneα-螺旋
Alpha-helix (%)β-折叠
Beta-turn (%)无规卷曲
Random coil (%)延伸链
Extended strand (%)亚细胞定位
Subcellular localizationhbae1 66.43 4.20 19.58 9.79 Mitochondrion hbae3 58.29 6.29 22.29 13.14 Cytoplasm, Extracell hbae4 63.83 4.26 22.70 9.22 Cytoplasm hbae5 65.73 4.20 21.68 8.39 Mitochondrion hbbe1.1 65.31 6.80 17.69 10.20 Mitochondrion hbbe1.2 70.75 6.12 17.01 6.12 Mitochondrion hbbe2 63.27 3.40 24.49 8.84 Mitochondrion hbaa1 67.13 4.90 16.78 11.19 Mitochondrion hbaa2 61.54 4.20 25.87 8.39 Mitochondrion hbba1 73.47 6.80 14.97 4.76 Mitochondrion hbba2 70.07 6.12 19.05 4.76 Mitochondrion ![]()
图 2 黄河高原鳅血红蛋白三级结构模型Figure 2. Protein tertiary structure model of Hemoglobin in Triplophysa pappenheimi2.3 血红蛋白基因家族成员蛋白结构域分析
以6个motif作为查询上限, 血红蛋白基因家族各成员不同聚类组间的motif分布差异较小(图 3a), hbae3多出3′端的motif 5、motif 6; hbae4缺少5′端的motif 2、motif 4, 而多出motif 5和motif 6; 其余组的成员均有4个motif。
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图 3 黄河高原鳅血红蛋白基因家族的Motif基序(a)、Domain结构域(b)及基因结构(c)Figure 3. Motif (a), domain (b), and gene structure (c) of the hemoglobin gene family in Triplophysa pappenheimiDomain分析显示(图 3b), hbba1、hbba2、hbbe1.1、hbbe1.2、hbbe2属于β型血红蛋白基因家族, hbaa1、hbaa2、hbae1、hbae3、hbae4、hbae5属于α型血红蛋白基因家族。不同组内部的motif分布较为均匀, 其结构域相似, 具有较高的保守性。基因结构分析显示(图 3c), 11个血红蛋白基因均由3个外显子组成。
2.4 血红蛋白基因家族染色体定位分析
根据基因组注释文件中获取的黄河高原鳅血红蛋白基因家族所在染色体位置信息, 对血红蛋白基因家族成员在染色体分布进行可视化分析, 获得染色体定位图(图 4)。11个血红蛋白基因家族成员分布在2条染色体上, hbae1、hbae3、hbbe1.1、hbbe1.2、hbaa1、hbaa2、hbba1、hbba2分布在Chr 07上, 而hbae4、hbbe2、hbbe5分布在Chr 17上。
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图 4 黄河高原鳅血红蛋白基因在染色体上的分布Figure 4. Distribution of hemoglobin gene on chromosomes in Triplophysa pappenheimi2.5 血红蛋白基因在不同组织中的低氧胁迫响应模式
在本研究中, 首先利用RNA-seq方法检测了黄河高原鳅急慢性低氧胁迫后肝脏、鳃和血液中所有血红蛋白基因的表达模式(已上传国家基因库生命大数据平台https://db.cngb.org/, ID: CNP0006110)。基于FPKM (The fragments kilobase of exon model per million)组织表达量检测结果显示(表 4和图 5), 在常氧条件下, hbaa1、hbaa2、hbba1和hbba2基因在黄河高原鳅肝脏、鳃和血液中高表达, 而hbae4、hbbe1和hbbe2为微量表达基因, 其他3个基因(hbae1、hbae3和hbae5)均无表达; 在急性低氧胁迫12h后, hbaa1、hbaa2、hbba1和hbba2基因在肝脏、鳃和血液中的表达量略微上调, 而hbae4、hbbe1和hbbe2基因在组织和血液中的表达量基本维持不变; 在慢性低氧条件下, hbaa1、hbaa2、hbba1和hbba2在肝脏和鳃中的表达量呈现出先上升后下降的趋势; 在慢性低氧24h至96h时, 上述4个基因的表达量比对照上调2—3倍, 而在慢性低氧至168h时, 4个基因的表达量明显下降, 接近对照的表达量或略有上调。与肝脏和鳃相反, 在慢性低氧24h时, 血液中hbaa1、hbaa2、hbba1和hbba2基因表达量显著下调, 只有对照的一半左右, 而在慢性低氧96h和168时, 血液中上述4个基因的表达量上升至对照水平或略高。总体而言, 无论是常氧还是在低氧条件下, hbaa1和hbba1基因对在组织和血液中的表达量远高于hbaa2和hbba2基因对的表达量。
表 4 基于转录组数据的血红蛋白基因在不同组织中的相对表达量Table 4. The relative expression of hemoglobin genes in different tissues based on RNA-seq data组织Tissue 时间Time (h) 基因相对表达量 Relative expression of gene hbae4 hbbe1 hbbe2 hbaa1 hbaa2 hbba1 hbba2 肝脏Liver 0 0.06 0.22 0.63 447.34 150.68 447.78 48.50 12 0.07 0.22 0.52 481.01 204.95 676.54 70.12 24 0.12 0.35 0.50 1333.31 554.80 1336.64 177.50 96 0.16 0.31 0.33 1192.53 448.94 1109.33 113.44 168 0.13 0.30 0.62 835.76 354.51 871.58 71.14 鳃Gill 0 0.35 0.51 0.04 2253.08 957.55 2217.45 264.53 12 0.58 2.14 10.16 4603.07 2103.87 6968.25 776.39 24 1.26 1.34 4.46 6961.28 3612.67 6321.26 996.59 96 1.13 2.00 0.58 8994.12 3892.07 8518.22 857.03 168 0.73 1.75 1.82 3693.78 1528.61 4072.82 285.90 血液Blood 0 23.77 42.62 0.40 163575.34 64712.88 189796.58 20481.05 12 15.11 96.02 3.22 187315.80 82866.30 331174.66 39786.25 24 13.01 16.84 9.21 102190.19 43706.21 127182.48 16116.07 96 21.54 58.55 1.13 222169.69 87838.61 226260.85 24392.49 168 29.12 86.19 17.44 201510.76 66919.83 217962.24 19762.22 ![]()
图 5 血红蛋白基因在不同组织的表达热图Figure 5. Heat map of hemoglobin gene expression in different tissues接着, 用qRT-PCR方法检测了黄河高原鳅急慢性低氧胁迫后肝脏、鳃和血液中血红蛋白基因的表达模式(图 6), 因hbae4、hbbe1和hbbe2基因表达量低且不稳定, 此处仅展示hbaa1、hbba1、hbaa2和hbba2基因的表达结果。结果显示, qRT-PCR检测结果与RNA-seq结果基本相一致。在急性低氧胁迫12h后, hbaa1、hbaa2、hbba1和hbba2基因在肝脏、鳃和血液中的表达量具有上调趋势, 但是差异不显著(P<0.05); 在慢性低氧24h至96h时, hbaa1、hbba1、hbaa2和hbba2基因在肝脏和血液中的表达量达到峰值(P<0.05), 随着胁迫时间的延长, 上述基因的表达量有所下调。在鳃组织中, hbaa1、hbaa2和hbba1的最高表达量出现在慢性低氧后的196h, 而hbba2基因表达峰值出现在24h。
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图 6 血红蛋白各基因在各组织中的表达量a. 肝脏组织中的相对表达量; b. 鳃组织中的相对表达量; c. 血液中的相对表达量; 相同字母表示差异不显著(P>0.05); 不同字母表示差异显著(P<0.05)Figure 6. Expression levels of hemoglobin gene in various tissuesa. Relative expression in liver; b. Relative expression in gill; c. Relative expression in blood; The same letter indicates no significant difference (P>0.05), while different letters indicate significant differences (P<0.05)3. 讨论
3.1 黄河高原鳅血红蛋白基因库及其进化
与其他脊椎动物相比, 硬骨鱼拥有相对较大的血红蛋白基因库, 而且在不同鱼类之间血红蛋白基因家族的大小和成员组成具有明显的差异[10, 31, 32]。比如, 斑马鱼基因组拥有17个血红蛋白基因, 其中11个基因(hbae1.1、hbae1.2、hbae1.3、hbbe1.1、hbbe1.2、hbbe1.3、hbae3、hbae4、hbae5、hbbe2、hbbe3)编码7个胚胎/仔鱼型血红蛋白(hbae1、hbbe1、hbae3、hbae4、hbae5、hbbe2和hbbe3), 6个基因(hbaa1.1、hbaa1.2、hbba1.1、hbba1.2、hbaa2和hbba2)编码4个成年型血红蛋白(hbaa1、hbba1、hbaa2和hbba2)[10, 31]。花斑裸鲤(Gymnocypris eckloni)基因组拥有19个血红蛋白基因, 分别编码5个胚胎/仔鱼型血红蛋白(hbae1、hbae4、hbae5、hbbe1和hbbe3), 以及4个成年型血红蛋白(hbaa1、hbaa2、hbba1和hbba2)[33]。鲤(Cyprinus carpio)、鲫(Carassius auratus)和滇池金线鲃(Sinocyclocheilus grahami) 基因组拥有更多的血红蛋白基因[25]。
硬骨鱼类血红蛋白基因数量和种类的变化是鱼类在长期的进化历程中由于基因组加倍和基因复制或删除的结果[10]。研究表明, 在脊椎动物共同祖先发生两轮全基因组复制[34—38], 硬骨鱼类经历了第三轮全基因组复制[39], 这次硬骨鱼类特异性基因组复制(Teleost-specific genome duplication, TGD)事件及基因的复制或删除事件对硬骨鱼类血红蛋白基因和功能多样性产生了深刻的影响[10, 40]。以往研究发现[25], 大部分二倍体鱼类的血红蛋白基因由非连锁的2个基因簇(LA和MN基因簇)组成, 分别分布在2条染色体或连锁群上, 被认为源自硬骨鱼类特异性基因组复制。比如, 斑马鱼和露斯塔野鲮(Labeo rohita) 是典型的二倍体鱼类, 它们的基因组分别拥有17和16个血红蛋白基因, 均分布在2条染色体上; 而鲤(Cyprinus carpio)、鲫(Carassius auratus)和滇池金线鲃(Sinocyclocheilus grahami)被认为是四倍体鱼类, 经历了硬骨鱼类特异性基因组复制后的另一轮基因组复制事件, 它们的基因组拥有更多数量的血红蛋白基因, 并且分布在3—4个基因簇上。本研究通过本地数据库搜索, 在黄河高原鳅基因组中鉴定到11个血红蛋白基因(hbaa1、hbaa2、hbae1、hbae3、hbae4、hbae5、hbba1、hbba2、hbbe1.1、hbbe1.2和hbbe2), 且与斑马鱼和露斯塔野鲮相同, 其血红蛋白基因分布在2个连锁群上, 由此推断黄河高原鳅是二倍体鱼类[41], 其血红蛋白基因库源自硬骨鱼类特异性基因组复制。但是, 与斑马鱼和露斯塔野鲮相比, 黄河高原鳅血红蛋白基因数量明显偏少, 对此最有可能的解释是在黄河高原鳅基因组进化过程中发生了特定基因的丢失[10, 25]。
3.2 黄河高原鳅血红蛋白理化性质
除hbbe1.1、hbbe2、hbae3之外, Hb蛋白的理论等电点均大于7, 这表明除hbbe1.1、hbbe2、hbae3之外的基因产物是碱性蛋白, 而hbbe1.1、hbbe2、hbae3是酸性蛋白; 亲水性平均指数除hbbe2为负数, 其余均为正值, 不稳定指数除hbbe1.2大于40, 其余均小于40[42], 说明所有除hbbe2和hbbe1.2的血红蛋白均为疏水性稳定蛋白; 亚细胞定位显示除hbae4蛋白定位于细胞质上, hbae3位于细胞质与细胞外, 其余均定位于线粒体上, 表明它们属于线粒体蛋白。氧的代谢主要是在线粒体中进行, 线粒体是参与机体低氧调控的主要细胞器之一, 其对低氧环境极为敏感。在低氧环境中, 线粒体中电子受体氧分子供应不足, 进而导致活性氧(ROS)的大量产生[43]。蛋白质的三级结构模型显示, 与二级结构预测一致, 血红蛋白主要由α-螺旋组成。
3.3 黄河高原鳅血红蛋白基因对低氧胁迫的响应
黄河高原鳅11个血红蛋白基因家族成员分布在假定染色体Chr 07和Chr 17上, 也就是MN基因簇位于Chr07染色体上, 包括hbae1、hbae3、hbbe1.1、hbbe1.2、hbaa1、hbaa2、hbba1和hbba2基因; LA基因簇位于Chr 17染色体上, 包括hbae4、hbbe2和hbbe5基因。在二倍体鱼类中, 早期发育阶段(胚胎期、仔鱼期)主要表达的血红蛋白基因是位于LA基因簇的hbae3、hbae5、hbbe2、hbbe3, 以及MN基因簇3′端的hbae1、hbbe1和hbae3基因; 在发育后期(幼鱼期、成年期)主要表达的血红蛋白基因是位于MN基因簇5′端的hbaa1、hbaa2、hbba1和hbba2[25]。在花斑裸鲤(Gymnocypris eckloni)和黄河裸裂尻鱼(Schizopygopsis pylzovi)中, 不是所有的位于LA基因簇的基因都在早期发育阶段表达, 也不是只有MN基因簇5′端的基因在发育后期表达[30, 32]。本研究中黄河高原鳅样本均为成体, RNA-seq和qRT-PCR检测结果均表明, 胚胎/仔鱼型血红蛋白基因hbae1、hbae3、hbae4、hbae5、hbbe1和hbbe2在成体中不表达或微量表达, 而成年型血红蛋白基因hbaa1、hbaa2、hbba1 和 hbba2均为高表达, 该结果与已有研究相一致[31, 32, 44]。
应对低氧环境, 不同鱼类血红蛋白表达模式有所不同。比如, 成年型斑马鱼在慢性低氧和急性低氧48h后, 其组织中成年型血红蛋白基因hbaa和hbba转录水平的表达量显著下降[10]; 而成年型鲫(Carassius auratus)在同样急慢性低氧条件下其α和β珠蛋白转录水平的表达量基本保持不变[12]; 但是, 青鳉在急慢性低氧条件下其血红蛋白基因转录组水平的表达量明显上调[45]。前期课题组的研究发现, 黄河裸裂尻鱼在急性低氧(DOC=0.3 mg/L) 4h后, 其肝胰脏、脾脏和肾脏中hbaa和hbba转录水平的表达量显著降低; 在慢性低氧(DOC=3.0 mg/L) 12h时, hbaa和hbba在肾脏中的表达量明显上升, 之后持续降低, 而在脾脏和肝胰脏中, 慢性低氧12h、24h、36h、48h、60h和72h后hbaa和hbba的表达量明显降低[24]。在本研究中, 急性低氧胁迫12h后, hbaa1、hbaa2、hbba1和hbba2基因在黄河高原鳅肝脏、鳃和血液中的表达量略微上调; 在慢性低氧条件下, hbaa1、hbaa2、hbba1和hbba2在肝脏和鳃中的表达量呈现出先上升后下降的趋势; 与肝脏和鳃相反, 在慢性低氧24h时, 血液中hbaa1、hbaa2、hbba1和hbba2基因表达量显著下调, 而在慢性低氧96h和168h时, 血液中上述4个基因的表达量上升至0h水平或略高。同时发现, 黄河高原鳅hbaa1-hbba1基因对在低氧条件下的表达量及其变化幅度远大于hbaa2-hbba2基因对, 揭示hbaa1-hbba1基因对针对低氧环境的敏感性要高于hbaa2-hbba2基因对, 表明hbaa1-hbba1基因对在黄河高原鳅低氧适应中发挥主导作用。
目前针对鱼类血红蛋白的低氧适应性表达调控存在三种解释, 一是低氧条件下关闭血红蛋白转录合成机器, 启动机体的节能机制[10]; 二是增强血红蛋白转录水平, 提高血液输氧能力, 保障组织脏器官在低氧条件下的需氧[45]; 三是节能和储血调控机制[24]。在本研究中, 急性低氧引起黄河高原鳅组织器官和血液中血红蛋白表达量上调, 在慢性低氧条件下肝脏和鳃呈现出先上升后下降的趋势, 其可能的解释是鳃和肝脏是鱼类最为重要且敏感的组织, 低氧初期为保证重要器官的生理机能, 血循环中的血红蛋白向重要器官集中, 引起重要组织器官表达量暂时上升, 而血液中血红蛋白表达量明显下降。随着低氧时间的延长, 造血器官增强血红蛋白转录机器, 致使血循环中的表达量逐步恢复。尽管RNA-seq和qRT-PCR数据基本支持这一推断, 但是还需进一步深入研究证实。
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图 1 斑马鱼和黄河高原鳅血红蛋白系统进化树
Figure 1. Phylogenetic tree of hemoglobin from Danio rerio and Triplophysa pappenheimi based on the protein sequences
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图 2 黄河高原鳅血红蛋白三级结构模型
Figure 2. Protein tertiary structure model of Hemoglobin in Triplophysa pappenheimi
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图 3 黄河高原鳅血红蛋白基因家族的Motif基序(a)、Domain结构域(b)及基因结构(c)
Figure 3. Motif (a), domain (b), and gene structure (c) of the hemoglobin gene family in Triplophysa pappenheimi
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图 4 黄河高原鳅血红蛋白基因在染色体上的分布
Figure 4. Distribution of hemoglobin gene on chromosomes in Triplophysa pappenheimi
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图 5 血红蛋白基因在不同组织的表达热图
Figure 5. Heat map of hemoglobin gene expression in different tissues
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图 6 血红蛋白各基因在各组织中的表达量
a. 肝脏组织中的相对表达量; b. 鳃组织中的相对表达量; c. 血液中的相对表达量; 相同字母表示差异不显著(P>0.05); 不同字母表示差异显著(P<0.05)
Figure 6. Expression levels of hemoglobin gene in various tissues
a. Relative expression in liver; b. Relative expression in gill; c. Relative expression in blood; The same letter indicates no significant difference (P>0.05), while different letters indicate significant differences (P<0.05)
表 1 用于qRT-PCR 分析的引物序列
Table 1 Primer sequences for qRT-PCR analysis
基因
Gene序列
Sequence (5′—3′)退火温度
Annealing
temperature (℃)β-actin F GAACCCCAAGGCTAACAGAGAA 56.9 β-actin R AGGCATACAGGGACAGCACA 59.1 hbae1 F TGGTGTTGGTGAAGCTGTTGAGAA 58.8 hbae1 R GCCAGAACGACGAGTATGTTGTGA 59.3 hbae3 F GAGCCAGGAACTTATCCACAGACA 58.7 hbae3 R CCTCAGACCAAGACCTACTTCTCC 58.8 hbae4 F CATTTACGCTGCCACGGGAAGAA 60.4 hbae4 R TGCTGAGGTGTGCCAGTGTAGT 61.2 hbae5 F TCTCACTGGAGCGACCTGACAC 61.7 hbae5 R GGAAGAGCATGGCAATCACAACAAG 59.0 hbbe1.1 F TACAACGCCGCCGCCATCAT 63.2 hbbe1.1 R GAGGAGACCACAACAGCGAGGAA 61.6 hbbe1.2 F TACAACGCCGCCGCCATCAT 63.2 hbbe1.2 R AGAGACCACAACAGCGAGGAACTT 60.5 hbbe2 F ACTCAGCGGTACTTCGGCAGTT 61.3 hbbe2 R GCAGCAATCACGATAGTCAGGCAAT 59.8 hbaa1 F GACAAGGACAAGGCTGCCGTAAG 61.0 hbaa1 R TGAGCGAAGTAGGTCTTGGTCTGAG 60.3 hbaa2 F ACGATCTTGTTGGTGGATTGAGCAA 58.7 hbaa2 R AGCAGATACAGCCGACAGGAACT 60.5 hbba1 F TCCACCTTCGGCAACCTGTCA 61.8 hbba1 R AGCGGACACGACCACAGACA 61.9 hbba2 F GCCTTTACGCCAAACTAAGCAAACT 58.1 hbba2 R GCCACGACGACAGACAGGAATT 60.1 
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表 2 黄河高原鳅血红蛋白基因家族成员理化性质
Table 2 Physical and chemical properties of hemoglobin gene family members in Triplophysa pappenheimi
基因
GeneCDS长度
CDS length
(bp)氨基酸数目
Number of
amino acid分子质量
Molecular
weight (ku)理论等电点
Theoretical
isoelectric point脂溶性指数
Aliphatic
index亲水性平均值
Grand average of
hydropathicity不稳定性指数
Instability
indexhbae1 444 143 15615.17 9.16 103.71 0.064 23.46 hbae3 528 175 19411.69 6.37 112.57 0.245 24.81 hbae4 426 141 15971.74 9.58 94.89 0.040 39.90 hbae5 432 143 15796.51 9.04 101.68 0.121 24.35 hbbe1.1 444 147 16417.94 6.96 96.87 0.083 16.63 hbbe1.2 444 147 16426.95 7.01 96.87 0.085 96.87 hbbe2 444 147 16786.39 6.90 94.22 –0.073 11.10 hbaa1 432 143 15552.07 8.89 99.65 0.129 21.91 hbaa2 432 143 15556.10 9.33 100.98 0.097 16.03 hbba1 444 147 16113.64 7.70 88.98 0.086 20.53 hbba2 444 147 16181.79 8.89 99.52 0.134 9.90
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表 3 黄河高原鳅血红蛋白基因家族成员二级结构和亚细胞定位
Table 3 Secondary structure and subcellular localization of hemoglobin gene family members in Triplophysa pappenheimi
基因
Geneα-螺旋
Alpha-helix (%)β-折叠
Beta-turn (%)无规卷曲
Random coil (%)延伸链
Extended strand (%)亚细胞定位
Subcellular localizationhbae1 66.43 4.20 19.58 9.79 Mitochondrion hbae3 58.29 6.29 22.29 13.14 Cytoplasm, Extracell hbae4 63.83 4.26 22.70 9.22 Cytoplasm hbae5 65.73 4.20 21.68 8.39 Mitochondrion hbbe1.1 65.31 6.80 17.69 10.20 Mitochondrion hbbe1.2 70.75 6.12 17.01 6.12 Mitochondrion hbbe2 63.27 3.40 24.49 8.84 Mitochondrion hbaa1 67.13 4.90 16.78 11.19 Mitochondrion hbaa2 61.54 4.20 25.87 8.39 Mitochondrion hbba1 73.47 6.80 14.97 4.76 Mitochondrion hbba2 70.07 6.12 19.05 4.76 Mitochondrion
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表 4 基于转录组数据的血红蛋白基因在不同组织中的相对表达量
Table 4 The relative expression of hemoglobin genes in different tissues based on RNA-seq data
组织Tissue 时间Time (h) 基因相对表达量 Relative expression of gene hbae4 hbbe1 hbbe2 hbaa1 hbaa2 hbba1 hbba2 肝脏Liver 0 0.06 0.22 0.63 447.34 150.68 447.78 48.50 12 0.07 0.22 0.52 481.01 204.95 676.54 70.12 24 0.12 0.35 0.50 1333.31 554.80 1336.64 177.50 96 0.16 0.31 0.33 1192.53 448.94 1109.33 113.44 168 0.13 0.30 0.62 835.76 354.51 871.58 71.14 鳃Gill 0 0.35 0.51 0.04 2253.08 957.55 2217.45 264.53 12 0.58 2.14 10.16 4603.07 2103.87 6968.25 776.39 24 1.26 1.34 4.46 6961.28 3612.67 6321.26 996.59 96 1.13 2.00 0.58 8994.12 3892.07 8518.22 857.03 168 0.73 1.75 1.82 3693.78 1528.61 4072.82 285.90 血液Blood 0 23.77 42.62 0.40 163575.34 64712.88 189796.58 20481.05 12 15.11 96.02 3.22 187315.80 82866.30 331174.66 39786.25 24 13.01 16.84 9.21 102190.19 43706.21 127182.48 16116.07 96 21.54 58.55 1.13 222169.69 87838.61 226260.85 24392.49 168 29.12 86.19 17.44 201510.76 66919.83 217962.24 19762.22
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