THE EXPRESSION ANALYSIS OF FBXO32 GENE IN LIVER OF TRAF6 MUTANT ZEBRAFISH
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摘要: 为了进一步研究fbxo32在肝脏相关疾病中的作用, 进行了traf6缺失斑马鱼Danio rerio肝脏的组织切片分析, 结果显示斑马鱼traf6缺失个体表现出明显的肝萎缩特征, 包括肝脏组织结构松散、肝细胞排列不规则及缺少肝脂肪滴等症状。同时荧光定量实验表明fbxo32 mRNA在检测过的野生型斑马鱼组织中均有一定量的表达, 在肝脏中表达量较低而在卵巢中表达量较高。而与野生型斑马鱼相比, fbxo32 mRNA在traf6突变体斑马鱼肝脏中的表达量上调超过100倍。进一步原位杂交结果显示, fbxo32 mRNA的信号主要集中于肝脏细胞, 而在血细胞中则没有检测到信号。特别是与野生型斑马鱼相比, fbxo32 mRNA在traf6突变型斑马鱼肝脏中的信号明显增强。实验结果表明traf6缺失能引起fbxo32基因的上调表达, 并会导致traf6突变型斑马鱼肝脏发育异常并发生萎缩。Abstract: fbxo32, a muscle-specific E3 ubiquitin ligase, can enhance protein degradation to associate with atrophy. Here, we found that traf6 mutant zebrafish liver fbxo32 mRNA level increased dramatically. To find out the role of fbxo32 in liver disease, we performed histological analysis of mutant and wildtype zebrafish liver. The result showed that the mutant liver exhibited apparent characteristics of liver atrophy, such as loose liver tissue structure, irregular arrangement and rare lipid droplets of the hepatocytes. The qRT-PCR result showed that fbxo32 mRNA was widely expressed in most tested tissues with the highest level in ovary and low level in liver of wildtype zebrafish. Especially, compared with the wildtype, the liver fbxo32 mRNA was elevated about 100 folds in the traf6 mutant. Additionally, fbxo32 mRNA was mainly distributed in hepatocytes based on in situ hybridization, but cannot be detected in blood cells. The signal of fbxo32 mRNA was much stronger in traf6 mutant liver. These findings indicate that the knockout of traf6 might induce the expression of fbxo32 mRNA in liver and result in liver developmental abnormality and atrophy.
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Keywords:
- Hepatic atrophy /
- fbxo32 /
- traf6 mutant /
- In situ hybridization /
- Zebrafish
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Fbox32(也被称为atrogin-1或MAFbx)是F-box蛋白家族的一员, 而F-box蛋白家族是SCF泛素蛋白连接酶复合物中的一类亚单位蛋白, 它能够特异性地识别磷酸化的底物, 而不同的F-box蛋白可以相应地识别不同的磷酸化底物[1]。许多研究表明, Fbox32在各种原因引起的肌肉萎缩中起着关键的作用。如有研究发现, 在禁食导致的小鼠(Mus musculus)肌肉萎缩过程中, fbxo32基因在小鼠骨骼肌中的表达量上调超过9倍[2]。在小鼠肌小管中, fbxo32基因的大量表达导致肌小管出现萎缩现象, 而当敲除小鼠的fbxo32基因后, fbxo32–/–基因型小鼠肌肉萎缩的症状相比野生型小鼠明显减轻[3]。更有进一步的研究发现, 转录因子Foxo可以通过诱导fbxo32的表达使小鼠肌肉发生萎缩, 而IGF-PI3K-AKT信号通路则能通过使转录因子Foxo失活来抑制fbxo32的表达[4]。此外, fbxo32和endophilin-A之间的相互作用有助于维持泛素蛋白酶系统的稳定和神经元的健康[5]。在鸡(Gallus gallus)中, fbxo32的高表达会加快肌肉蛋白的降解速率[6]。同样, 有研究表明在禁食的虹鳟(Oncorhynchus mykiss)中, fbxo32的高表达可能与鱼体骨骼肌和平滑肌的萎缩相关[7]。在斑马鱼(Danio rerio)中, fbxo32的缺失会导致心肌发育及心脏功能异常[8]。
值得关注的是, 本研究组最近研究发现traf6基因的缺失能引起肝脏组织基因转录本表达谱的改变, 特别是fbxo32转录本的表达水平的变化尤为显著, 其在traf6基因突变体斑马鱼肝脏中的表达异常增加近100倍(与野生型相比)。为了进一步研究斑马鱼fbxo32生理功能, 我们进行了斑马鱼肝脏组织学分析; fbxo32转录本组织特异性分析, 进一步比较分析了fbxo32转录本在traf6突变体与野生型斑马鱼的相关组织中的差异表达。特别是通过冰冻切片原位杂交技术, 深入分析了fbxo32转录本在traf6突变体与野生型斑马鱼肝脏组织的细胞定位及差异表达。本研究结果进一步利用斑马鱼这一优异的人类疾病研究模式生物[9, 10], 为探讨相关疾病特别是肝萎缩的病理机制提供了新的线索及靶标。
1. 材料与方法
1.1 实验动物
本实验所用野生型斑马鱼(traf6+/+)和纯合型traf6突变体斑马鱼(traf6–/–)均来自中国水产科学研究院珠江水产研究所, traf6–/–斑马鱼是由本所研究团队通过CRISPR/Cas9基因敲除技术获得, 该突变体为traf6第二外显子发生蛋白编码移框突变, 导致Traf6蛋白缺失(未发表数据)。
1.2 cDNA的制备
本研究提取的野生型斑马鱼体组织包括: 脑、肝脏、脾脏、肾脏、精巢、卵巢、肌肉和肠。提取的纯合型斑马鱼体组织包括: 脑、肝脏、脾脏、肾脏和精巢。各个组织的总RNA是根据说明书, 用TRIzol法提取得到的, 提取的各组织总RNA均用DNaseⅠ处理。然后用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒并按照试剂盒附带的说明书将RNA反转录获得相应的cDNA。
1.3 肝脏组织学分析
2月龄野生型和纯合型斑马鱼各取1尾, 对斑马鱼进行麻醉后, 在4℃下固定于4% PFA(Paraformaldehyde, PFA)中, 固定48h。在固定完成后对斑马鱼样品进行脱水、渗透和石蜡包埋处理, 然后用病理切片机(RM2016, Leica)将包埋好的样品切片, 切片厚度为1 µm。最后将组织切片进行HE(Ehematoxylin and eosin)染色, 染色后的切片将用于常规组织学检查。
1.4 fbxo32基因在斑马鱼各个组织中表达分析
用荧光定量qRT-PCR法, 以EF1α为内参基因, 检测斑马鱼fbxo32基因在不同组织中的相对表达情况。qRT-PCR所用的试剂盒为iTaqTM Universal SYBR® Green Supermix, 进行qRT-PCR反应的仪器为StepOnePlus。PCR反应条件为: 95℃ 2 min; 95℃ 15s, 60℃ 30s, 72℃ 30s, 40个循环; 95℃ 15s, 60℃ 1min, 95℃ 15s。用2–∆∆Ct法将对应的结果与对照组结果进行比较得出相对表达量[18]。计算数据分别来自3个重复组。引物序列如表 1所示。
表 1 引物序列Table 1. Primers list引物名称
Primer name引物序列
Sequence (5′—3′)用途
Applicationfbxo32-F ACTGCCAATAACCCAGAGAGC 荧光定量 fbxo32-R CCCTGCCTCAAGTCATCCA 荧光定量 TZ-fbxo32-F ATTTAGGTGACACTATAGAAA
CTGCCAATAACCCAGAGAGC原位杂交 TZ-fbxo32-R TAATACGACTCACTATAGGG
CCCTGCCTCAAGTCATCCA原位杂交 1.5 冰冻切片原位杂交
原位杂交中合成探针所用的引物TZ-fbxo32-F和TZ-fbxo32-R的序列如表 1所示。用引物通过PCR反应合成带有SP6启动子和T7启动子的DNA, 将所得DNA纯化, 再以经过纯化后DNA为模板, 用DIG RNA Labeling Kit试剂盒分别合成带地高辛(Digoxigenin)标记的反义RNA探针和正义RNA探针。成鱼肝脏组织: 各取1条野生型成鱼和纯合型成鱼的肝脏组织, 再经过4%PFA固定12—18h, 用不同浓度(25%、50%、75%和100%)的甲醇溶液(用DEPC水处理过的PBS配制)梯度脱水, 最后组织置于100%甲醇保存于–20℃备用。切片前将保存的肝脏组织取出用不同浓度甲醇梯度复水, 然后置于30%蔗糖在–4℃渗透过夜。在切片时, 用OCT包埋组织后进行冰冻切片, 切片厚度为4 μm。在切片准备完毕后, 用带地高辛标记的RNA探针进行原位杂交。具体原位杂交步骤参考之前研究采用的方法[11]。
1.6 统计学处理
荧光定量结果使用Prism 6软件处理并作图, 结果表示为平均值±SEM。用SPSS 20.0软件中的T检验进行差异显著性分析, P<0.05表示差异显著并用*标记, P<0.01表示差异极显著用**标记。
2. 结果
2.1 traf6突变体肝脏组织发生病变
通过斑马鱼肝脏组织的石蜡切片及苏木精伊红染色组织学比较分析, 发现traf6突变体肝脏组织发生了明显的病理变化, 具体表现为肝脏组织结构松散零乱, 肝细胞脂肪滴稀少; 相反, 野生型肝脏组织中肝脏细胞胞体大, 排列规则, 其脂肪滴多且明显(图 1)。
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图 1 traf6缺失斑马鱼肝脏组织结构异常2月龄斑马鱼肝脏组织横切面组织学分析, 通过石蜡包埋切片及苏木精伊红染色, 进行traf6缺失斑马鱼肝脏组织(A)与野生型肝脏组织(B)的比较分析。肝细胞核用箭头标示, 肝细胞脂肪滴用星号标示。比例尺, 20 μmFigure 1. traf6 deficiency causes the abnormality of liverThe transverse sections of 2-month-old zebrafish liver. A, liver of traf6–/– zebrafish. B, liver of wild-type (wt) zebrafish. Liver nucleus were indicated by arrows. Stars for the Lipid droplets of hepatocytes. Scale bars, 20 μm2.2 斑马鱼基因的组织表达
本实验通过qRT-PCR技术分析了斑马鱼fbxo32基因在野生型斑马鱼体组织(包括肝脏、肌肉、脑、脾脏、肾脏、精巢、卵巢和肠道)的组织特异性表达分析。结果显示, 在野生型斑马鱼中, fbxo32在各个组织中都有表达, 其中在肝脏中表达量最低, 在肌肉等组织中的表达量比较高(图 2)。进而, 我们比较分析了fbxo32在野生型和traf6突变体斑马鱼的肝脏和肾脏等组织中的差异表达, 结果发现fbxo32在traf6突变体斑马鱼肝脏的表达量相对其他组织来说是最高的, 并与野生型斑马鱼肝脏相比增加了近100倍(图 3)。结果暗示了traf6基因的缺失会诱导fbxo32在斑马鱼肝脏中的异常高表达。
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图 2 fbxo32转录本在野生型斑马鱼各组织中的表达Figure 2. The expression of fbxo32 mRNA in different tissues of wildtype zebrafish![]()
图 3 fbxo32转录本在野生型和traf6突变体斑马鱼相关组织中的表达差异Figure 3. The differential expression of fbxo32 mRNA in different tissues between wild type and traf6 mutant zebrafish2.3 fbxo32基因在肝脏组织中的表达
为了进一步分析fbxo32 mRNA在斑马鱼肝脏组织中的表达变化及细胞定位, 我们进行了traf6突变体及野生型斑马鱼肝脏组织的冰冻切片及fbxo32 mRNA的原位杂交分析。结果表明在traf6突变体肝脏组织中, fbxo32 mRNA杂交信号明显比野生型肝脏组织的强(图 4)。进一步结合PI染色结果分析, 发现无论在traf6突变体肝脏组织还是在野生型斑马鱼肝脏组织中, fbxo32 mRNA杂交信号均特异分布在肝脏细胞中(细胞核比较圆), 而在肝脏组织中的其他细胞, 比如血细胞(细胞核长呈梭型)中就难以检测到杂交信号(图 5)。
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图 4 fbxo32转录本在肝脏组织中的表达水平通过原位杂交技术用fbxo32正义探针(A, D)和反义探针(B, E)检测了fbxo32转录本在突变型斑马鱼(traf6–/–)和野生型斑马鱼(traf6+/+)中的表达。A、B. traf6–/–斑马鱼肝脏切片；D、E. traf6+/+斑马鱼肝脏切片；C、F. 阳性信号局部放大图。fbxo32的信号已用黑色箭头标出。比例尺, 20 μmFigure 4. The expression level of fbxo32 mRNA in zebrafish liver tissueThe fbxo32 mRNA expression was examined by in situ hybridization on cryo-sections of livers in traf6 mutant (traf6–/–) and wildtype (traf6+/+) zebrafish with fbxo32 antisense (A, D) or sense probes (B, E). A, B. sections of traf6–/– zebrafish liver; D, E. sections of traf6+/+ zebrafish liver; C, F. drawing of partial enlargement. Signals of fbxo32 mRNA were highlighted with black arrows. Scale bars, 20 μm![]()
图 5 fbxo32转录本在斑马鱼肝脏组织中的细胞定位2月龄斑马鱼肝脏组织的横向切片, 包括traf6–/–斑马鱼肝脏(A—C)和traf6+/+斑马鱼肝脏(D—F)；紫色代表fbxo32转录本的信号；箭头指示的是肝脏细胞, 其细胞核较圆；bc. 血细胞, 细胞核长且梭型; ld. 肝脏细胞脂肪滴; 比例尺, 20 μmFigure 5. The cellular distribution of fbxo32 mRNA in zebrafish liver tissuesThe transverse sections of 2-month-old zebrafish livers, including the traf6–/– liver (A—C) and the traf6+/+ liver (D—F). The signals of fbxo32 mRNA were shown in purple. The arrows indicates the hepatocytes with round nuclear. bc, for blood cells with oral nuclear. ld, for the lipid droplets of hepatocytes. Scale bars, 20 μm3. 讨论
本研究通过荧光定量技术分析了fbxo32基因在斑马鱼不同组织中的表达情况, 结果显示, fbxo32在不同组织中都有广泛的表达, 在肌肉和卵巢组织中的表达量最高, 其次是脾脏和脑等组织。这一结果与其他物种中的fbxo32基因表达谱非常相似。比如在哺乳动物中, fbox32主要在心肌和骨骼肌细胞中表达[3], 在虹鳟[7]和大西洋鲑Salmo salar[12]中, fbxo32也是在各种组织中广泛表达, 并且相对而言, 在肌肉中表达量较高。另外, 有研究报道fbxo32在卵巢癌和食管鳞状细胞癌中发生了表观遗传学沉默, 而重启fbxo32的表达则可以抑制卵巢癌细胞的增殖[13, 14], 这暗示着 fbxo32基因不仅在哺乳类和鱼类的肌肉和心脏中起着蛋白质降解的作用[3, 7, 12], 在调控动物卵巢(包括斑马鱼卵巢)的蛋白降解过程中也发挥着重要的调控作用, 而这还需要更进一步的研究来验证。
值得注意的是, 有许多文献证明了fbxo32能够将特定蛋白质底物呈递给泛素分子[2, 3], 并在使其失活和对其进行标记后最终通过蛋白酶体进行降解[15]。而在哺乳动物中, fbxo32的上调能够加快与肌萎缩相关的蛋白质的分解代谢[3]。因此, 在动物中fbxo32的表达上调将会导致肌萎缩。而本研究发现, 在traf6–/–斑马鱼的肝脏中fbxo32表达量相比traf6+/+斑马鱼肝脏上调了超过100倍, 类似地, 在发生了各种萎缩症状的虹鳟、大西洋鲑和其他动物中也都观察到了fbxo32表达量的上调。另外, 与野生型斑马鱼肝脏相比, traf6突变体斑马鱼肝脏也表现出了一些肝脏萎缩的症状, 如肝脏组织结构形态不规则和松散、肝脂肪滴缺失等。综上所述, 我们可以得出结论: 斑马鱼traf6基因的缺失会导致fbxo32转录本的上调和肝脏萎缩。这个结论与在哺乳动物中的研究结果相近: 在哺乳动物中fbxo32的表达上调与骨骼肌的萎缩相关[16, 17]。然而, 要探明traf6与fbxo32之间的调控机制还有待将来更深入的研究。本研究首次发现了肝萎缩中fbxo32转录本的上调, 这一发现有助于进一步开展对fbxo32基因的生理功能研究及阐明动物肝脏相关疾病发生的分子机制。
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图 1 traf6缺失斑马鱼肝脏组织结构异常
2月龄斑马鱼肝脏组织横切面组织学分析, 通过石蜡包埋切片及苏木精伊红染色, 进行traf6缺失斑马鱼肝脏组织(A)与野生型肝脏组织(B)的比较分析。肝细胞核用箭头标示, 肝细胞脂肪滴用星号标示。比例尺, 20 μm
Figure 1. traf6 deficiency causes the abnormality of liver
The transverse sections of 2-month-old zebrafish liver. A, liver of traf6–/– zebrafish. B, liver of wild-type (wt) zebrafish. Liver nucleus were indicated by arrows. Stars for the Lipid droplets of hepatocytes. Scale bars, 20 μm
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图 2 fbxo32转录本在野生型斑马鱼各组织中的表达
Figure 2. The expression of fbxo32 mRNA in different tissues of wildtype zebrafish
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图 3 fbxo32转录本在野生型和traf6突变体斑马鱼相关组织中的表达差异
Figure 3. The differential expression of fbxo32 mRNA in different tissues between wild type and traf6 mutant zebrafish
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图 4 fbxo32转录本在肝脏组织中的表达水平
通过原位杂交技术用fbxo32正义探针(A, D)和反义探针(B, E)检测了fbxo32转录本在突变型斑马鱼(traf6–/–)和野生型斑马鱼(traf6+/+)中的表达。A、B. traf6–/–斑马鱼肝脏切片；D、E. traf6+/+斑马鱼肝脏切片；C、F. 阳性信号局部放大图。fbxo32的信号已用黑色箭头标出。比例尺, 20 μm
Figure 4. The expression level of fbxo32 mRNA in zebrafish liver tissue
The fbxo32 mRNA expression was examined by in situ hybridization on cryo-sections of livers in traf6 mutant (traf6–/–) and wildtype (traf6+/+) zebrafish with fbxo32 antisense (A, D) or sense probes (B, E). A, B. sections of traf6–/– zebrafish liver; D, E. sections of traf6+/+ zebrafish liver; C, F. drawing of partial enlargement. Signals of fbxo32 mRNA were highlighted with black arrows. Scale bars, 20 μm
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图 5 fbxo32转录本在斑马鱼肝脏组织中的细胞定位
2月龄斑马鱼肝脏组织的横向切片, 包括traf6–/–斑马鱼肝脏(A—C)和traf6+/+斑马鱼肝脏(D—F)；紫色代表fbxo32转录本的信号；箭头指示的是肝脏细胞, 其细胞核较圆；bc. 血细胞, 细胞核长且梭型; ld. 肝脏细胞脂肪滴; 比例尺, 20 μm
Figure 5. The cellular distribution of fbxo32 mRNA in zebrafish liver tissues
The transverse sections of 2-month-old zebrafish livers, including the traf6–/– liver (A—C) and the traf6+/+ liver (D—F). The signals of fbxo32 mRNA were shown in purple. The arrows indicates the hepatocytes with round nuclear. bc, for blood cells with oral nuclear. ld, for the lipid droplets of hepatocytes. Scale bars, 20 μm
表 1 引物序列
Table 1 Primers list
引物名称
Primer name引物序列
Sequence (5′—3′)用途
Applicationfbxo32-F ACTGCCAATAACCCAGAGAGC 荧光定量 fbxo32-R CCCTGCCTCAAGTCATCCA 荧光定量 TZ-fbxo32-F ATTTAGGTGACACTATAGAAA
CTGCCAATAACCCAGAGAGC原位杂交 TZ-fbxo32-R TAATACGACTCACTATAGGG
CCCTGCCTCAAGTCATCCA原位杂交 
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