REGULATION OF HSP70 GENE BY NOTCH1A AND NOTCH1B IN ZEBRAFISH (DANIO RERIO)
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摘要:
研究旨在通过双荧光素酶报告基因实验探究斑马鱼notch1a和notch1b基因对hsp70的调控作用。通过NCBI数据库检索获取了斑马鱼notch1a和notch1b基因的CDS序列, 对其胞内段(Notch1a/Notch1b intracellular domain, N1aICD/N1bICD)进行克隆并构建pCMV-N1aICD和pCMV-N1bICD真核表达载体, 在人胚肾细胞(HEK293T)中用Western Blot和亚细胞定位检测N1aICD和N1bICD的表达。通过生信分析并克隆斑马鱼hsp70启动子序列, 构建pGL3-hsp70-pro报告基因, 并在HEK293T中检测该报告基因的双荧光素酶活性。之后在HEK293T细胞中过表达notch1a和notch1b基因, 通过双荧光素酶报告基因实验检测pGL3-hsp70-pro的活性变化, 以此探究notch1a和notch1b对hsp70基因的调控作用。实验结果显示真核表达载体pCMV-N1aICD和pCMV-N1bICD构建成功, Western Blot显示pCMV-N1aICD和pCMV-N1bICD可正常表达, 亚细胞定位显示N1aICD和N1bICD蛋白表达在HEK293T的细胞核中; 双荧光素酶实验显示pGL3-hsp70-pro报告基因在HEK293T细胞中具有活性, 是阴性对照质粒的3.7倍; 在HEK293T细胞中pCMV-N1aICD和pCMV-N1bICD真核表达载体能够显著增强pGL3-hsp70-pro的活性, 分别为对照组的4.9倍和5.1倍。实验结果表明斑马鱼 notch1a和notch1b基因可显著增强hsp70基因的表达, 为进一步研究Notch分子通过Hsp70进行抗感染免疫的分子机制提供了实验材料并奠定了理论基础。
Abstract:The aim of this study was to investigate the regulatory role of zebrafish (Danio rerio) notch1a and notch1b genes on hsp70 by using a dual luciferase reporter gene assay. The CDS sequences of zebrafish notch1a and notch1b genes were obtained through NCBI database search, and their intracellular domains (Notch1a/Notch1b intracellular domain, N1aICD/N1bICD) were cloned. Eukaryotic expression vectors, pCMV-N1aICD and pCMV-N1bICD, were constructed. The expressions of N1aICD and N1bICD were detected in human embryonic kidney cells (HEK293T) through Western Blot and subcellular localization. The zebrafish hsp70 promoter sequence was analyzed, cloned, and incorporated into the pGL3-hsp70-pro reporter gene, which was constructed and assayed for dual luciferase activity in HEK293T. Overexpression of notch1a and notch1b genes in HEK293T cells was performed, and changes in pGL3-hsp70-pro activity were detected using a dual-luciferase reporter gene assay. The results showed that the successful construction of eukaryotic expression vectors pCMV-N1aICD and pCMV-N1bICD. Western Blot analysis confirmed the normal expression of pCMV-N1aICD and pCMV-N1bICD, while the subcellular localization assay showed the normal expression in the nucleus of HEK293T cells. The dual-luciferase reporter gene showed that the pGL3-hsp70-pro reporter gene was active in HEK293T cells, exhibiting activity 3.7 times higher than that of the empty plasmid. Additionally, the pCMV-N1aICD and pCMV-N1bICD eukaryotic expression vectors significantly enhanced the activity of pGL3-hsp70-pro in HEK293T cells, showing increases of 4.9-fold and 5.1-fold compared to the control, respectively. The results indicated that zebrafish notch1a and notch1b genes play a substantial role in enhancing the expression of hsp70 gene. This provides experimental materials and a theoretical foundation for further investigation into the immune mechanism of Notch molecular in defense against infection and apoptosis through Hsp70.
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Keywords:
- notch1a /
- notch1b /
- hsp70 /
- Luciferase /
- Apoptosis /
- Danio rerio
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细胞凋亡(Apoptosis)是在宿主自身生理机能或其他外界环境因子作用影响下, 通过去除各种受损的和一些不必要的细胞来维持宿主内环境物质的基本稳定[1]。热休克蛋白(Heat shock proteins, Hsp)是一组高度保守的蛋白, 参与应激条件下细胞内分子的运输和保护。热休克蛋白70 (Hsp70)是热休克蛋白家族的重要成员和主要分子伴侣, 在细胞的细胞质和细胞核中参与蛋白质的折叠和易位。当细胞受到缺氧、热休克等刺激破坏时, 促凋亡因子将被激活释放进入到胞质, 形成凋亡小体并导致细胞发生凋亡[2], 同时细胞会表达高水平的Hsp70, 在多个水平上通过修复、重新合成受损蛋白并稳定未折叠蛋白来抑制细胞色素C的释放, 阻止Caspase-3活化上游细胞凋亡信号[3]。银色鲮脂鲤(Prochilodus argenteus)作为洄游性鱼类, 非洄游期精巢内Hsp70显著升高并抑制Caspase-3活性, 保护生殖细胞免受Caspase-3依赖性凋亡[4]。氧化应激会导致鲻(Mugil cephalus)肝细胞受损, 肝细胞中Hsp70的上调可以抑制细胞凋亡信号调节激酶1蛋白的表达, 抵抗应激条件下肝细胞的凋亡[5]。重组哈维弧菌(Vibrio harveyi)溶血素刺激海鲷(Mylio macrocephalus)成纤维细胞后, 降低细胞线粒体膜电位并激活Caspase-3诱导细胞凋亡, 通过急性热休克升高Hsp70表达量, 同时抑制细胞凋亡[6]。由此可见, Hsp70的抗凋亡功能在鱼类应对环境条件变化及抗病原菌感染方面发挥重要作用。
Notch信号通路是众多蛋白分子组成的复杂信号传导系统, 参与跨物种的各种生物学过程, 例如器官形成、组织功能和组织修复等[7]。成熟的Notch分子是由胞外结构域(Notch extracellular domain, NECD)、跨膜域(Transmembrane domain, TM)和胞内段(Notch intracellular domain, NICD)组成[8], 新合成出的Notch在S1位点被Furin-like蛋白酶切割, 形成一个以非共价键结合的单次跨膜蛋白。当胞外段与相邻细胞的配体结合后, Notch受体构象发生变化暴露出S2位点, 使其被ADAM金属蛋白酶切割部分胞外段。最后在S3位点由γ-分泌酶切割跨膜域并形成成熟的胞内段NICD, 再与DNA连接蛋白CSL (CBF-1, Su (H), Lag-1)结合[9], 在MAM (Mastermind)/Lag-3蛋白识别后三者形成Notch转录激活复合物, 从而调控下游靶基因的转录和翻译[10]。因此, Notch信号可能在几个水平上受到调控, 包括配体结合受体及在运输过程中Notch组分与伴侣蛋白的相互作用[11]。在哺乳动物中Notch1参与细胞凋亡已得到很好的证实。在人类成体细胞中发现提高Noch1和Noch3的表达量, 可以显著促进血管平滑肌细胞生长的同时抑制细胞凋亡[12]。在人类喉鳞状细胞癌组织中降低Nocth1的表达可以抑制癌细胞生长, 诱导癌细胞凋亡[13]。
在斑马鱼(Danio rerio)中存在notch1a和notch1b两个同源保守基因, 与哺乳动物的notch1基因高度相似。目前对Notch1a的研究主要关注于造血功能和骨髓生成[14]方面的作用, Notch1b在斑马鱼胚胎发育过程参与心脏瓣膜的形成[15]和血管生成[16]。研究发现在青鳉(Oryzias latipes)中高温热休克条件下青鳉精巢内细胞大量凋亡, 同时notch1a和notch3基因表达量升高, 如果抑制Notch1a的活性会导致精原干细胞的减少, 因此Notch1a能保护精原干细胞免受热应激导致的细胞凋亡[17]。鲤(Cyprinus carpio)胚胎在胚孔闭合阶段对热应激高度敏感, 高温刺激胚胎会增加胚胎中Caspase-3介导的细胞凋亡, 激活Hsp70可以抑制凋亡体的形成[18], 因此Notch1a和Hsp70均具有保护鱼类细胞免受热应激导致凋亡的功能。野生小鼠中发现Notch的配体Jagged1-和Delta-like1刺激活化的CD4 T细胞后, 细胞免疫共沉淀显示Hsp70和Notch1之间存在直接相互作用, 共定位于CD4 T的细胞核中[11], 但在硬骨鱼类中hsp70基因与Notch信号通路之间是否存在相应的调控关系未有报道, 我们猜测Notch1a和Notch1b会通过调控hsp70进而影响细胞的凋亡。
斑马鱼作为常见的模式生物其基因组信息明确, 70%的人类基因至少有一个斑马鱼直系同源基因[19], 大部分凋亡基因在斑马鱼与脊椎动物上有很高的保守性, 同时许多诱导哺乳动物细胞凋亡及检测凋亡的实验方法对斑马鱼也有效[20], 因此后续在斑马鱼体内研究凋亡和免疫具有很好的优势[21]。斑马鱼中存在的Notch1a和Notch1b是否具有与哺乳动物的Notch1相似的生物学功能目前并不清楚, 因此本研究以斑马鱼为研究对象, 克隆notch1a和notch1b基因的胞内段序列, 即从S3酶切位点开始, 包含一个RAM结构域、ANK重复序列和一个PEST结构域[22]的胞内段, 构建pCMV-N1aICD、pCMV-N1bICD真核表达载体和pGL3-hsp70-pro报告基因, 利用双荧光素酶报告基因系统探究notch1a和notch1b基因与hsp70基因的调控关系, 旨在为Notch分子的功能研究及鱼类细胞凋亡的分子调控机制提供理论基础。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
本实验用鱼为AB品系野生型斑马鱼, 购自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所斑马鱼技术平台。成熟斑马鱼交配产卵后由本实验室饲养, 参照(http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html)养殖方法进行, 遵照上海海洋大学实验动物伦理委员会的批准(SHOU-DW-2016-002)进行相应的实验, pCMV-Tag2B载体、pGL3-Enhancer 载体、内参质粒phRL-TK和HEK293T细胞(人胚肾细胞)由海军军医大学李楠教授惠赠; pMD™19-T Vector Cloning Kit (TaKaRa, 6013), T4连接酶(NEB, M0202S), 同源重组连接酶(Vazyme, C112-01), Hieff Trans® Liposomal Transfection Reagent (YSASEN, 40802ES02), 小鼠抗FLAG-tag单克隆抗体(YSASEN, 30503ES60), Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP(Invitrogen, 31430), HRP Conjugated Anti-beta Actin Recombinant Rabbit Monoclonal Antibody (Huabio, ET1702-67), Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 488 (Invitroge, 1834337), Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit (YSASEN, 11402ES60)。
1.2 斑马鱼notch1a、notch1b基因系统发育分析
登录NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), 搜索在线数据库中的Nucleotide数据库, 获得各物种的notch1和斑马鱼notch1a、notch1b基因的氨基酸序列, 将搜索到的氨基酸序列导入MEGA7.0软件中, 用邻接法构建系统进化树。通过DNAMAN将斑马鱼Notch1a及Notch1b氨基酸序列分别与人和小鼠的Notch1氨基酸序列进行比对。
1.3 斑马鱼notch1a、notch1b基因扩增
首先从NCBI网站下载斑马鱼notch1a基因(NM_131441.1)和notch1b 基因(NM_131302.2)的CDS序列, 提取受精后1 d的斑马鱼RNA并反转录成cDNA, 根据表 1引物notch1a-F1/R1和notch1b-F1/R1分别扩增notch1a基因和notch1b基因, 将PCR产物连接到pMD-19T载体上。将连接产物加置DH5α感受态细胞内进行转化, 涂板挑选单个菌落进行扩摇并送测鉴定, 测序成功后提取质粒。
表 1 实验所用引物序列Table 1. Primer sequence used in the experiment引物名称
Primer name序列
Sequence (5′—3′)用途
Usagenotch1a-F1 GGCCTCCAGTGGAAACCT CDS 序列扩增
Amplification of CDS sequencesnotch1a-R1 CTACTTGAAGGCTTCTGGAATATG notch1b-F1 CAAAGGCTCCGTGGTTTAT notch1b-R1 AAGCAGGCTTATGGAATGTG notch1a-F2 CGCGGATCCTCCAGGAAGAGGAAGCGGG 表达载体构建
Construction of expression vectornotch1a-R2 CCCAAGCTTCTTGAAGGCTTCTGGAATATGGTTCATC notch1b-F2 CGCGGATCCTCCCGTAAACGGCGCCG notch1b-R2 CCCAAGCTTCTTGAATTGCTCGGGCATGTG hsp70-F CGAGCTCTTACGCGTGCTAGCTGAAGTGGACGGATTGAGTGA 报告基因载体构建
Construction of reporter gene vectorhsp70-R ACTTAGATCGCAGATCTCGAGAAACACCTCGTCGGGGAAAA 1.4 构建斑马鱼N1aICD和N1bICD真核表达载体
根据目的基因序列及pCMV-Tag2B载体序列特点, 选择BamH Ⅰ和Hind Ⅲ作双酶切位点, 以上一步所得质粒为模板设计引物notch1a-F2/R2和notch1b-F2/R2 (表 1), 扩增自S3酶切位点后的胞内段NICD序列(图 1)。将PCR扩增产物和表达载体pCMV-Tag2B通过限制性内切酶进行双酶切, 并通过T4连接酶进行连接, 将连接产物加置DH5α感受态细胞内进行转化, 涂板挑选单个菌落进行扩摇并送测鉴定, 测序成功后提取无内毒素质粒, 于–20℃保存备用。获得pCMV-N1aICD和pCMV-N1bICD的真核表达载体质粒, 用Snapgene软件构建质粒图谱。
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图 1 斑马鱼Notch1a和Notch1b结构示意图NECD. 胞外结构域; TM. 跨膜域; NICD. 胞内段Figure 1. Structure diagram of zebrafish Notch1a and Notch1bNECD. Notch extracellular domain; TM. Transmembrane domain; NICD. Notch intracellular domain1.5 Western Blot法分析N1aICD和N1bICD蛋白的表达
首先将生长状态良好的HEK293T细胞接种到6孔细胞培养板中, 置37℃待细胞达到70%—80%融合率时开始进行转染。用Hieff Trans® Liposomal Transfection Reagent转染试剂将pCMV-N1aICD、pCMV-N1bICD和pCMV-Tag2B载体质粒转染至HEK293T细胞, 均转染1000 ng, 24h后提取总蛋白, 取30 µL蛋白样品进行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳, 通过湿转转膜法将跑完电泳的总蛋白转至NC膜上, 用5%的脱脂奶粉在室温下封闭1h, PBST漂洗5min, 重复3次。鼠源FLAG-tag抗体1﹕2000稀释后, 置于4℃冰箱孵育过夜, PBST漂洗5min, 重复3次。山羊抗鼠抗体1﹕2000稀释后孵育3h, PBST漂洗5min, 重复3次。配制显色液, 均匀滴于NC膜上, 观察Western Blot结果条带。
1.6 亚细胞定位检测N1aICD和N1bICD蛋白表达
首先将生长状态良好的HEK293T细胞接种到35 mm细胞培养皿中, 置37℃待细胞达到70%—80%融合率时开始进行转染。用转染试剂将pCMV-N1aICD、pCMV-N1bICD和pCMV-Tag2B载体质粒均转染2000 ng。转染24h后, 在培养皿中加1 mL 4%多聚甲醛固定15min, 贴壁吸去固定液, 加入1×PBS 漂洗5min, 重复3次。在培养皿中加500 µL提前预冷处理过的100%甲醇透化培养细胞, 置于–20℃冰箱孵育10min, 加入 1×PBS 漂洗5min, 重复此操作3次。加入封闭缓冲液(1×PBS/5% 正常山羊血清/0.3% Triton X-100)封闭样品1h。吸去封闭缓冲液, 孵育一抗(1×PBS/1% BSA/0.3% TritonX-100/1﹕1000 小鼠抗 FLAG-tag 单克隆抗体), 置于 4℃ 冰箱过夜, 加入1×PBS 漂洗5min, 重复3次。加入包含偶联荧光素的二抗, 并室温下避光孵育 1—2h, 用1×PBS 漂洗 3 次, 再加入DAPI, 避光孵育 1—2h。用1×PBS漂洗3次后, 在共聚焦显微镜(Leica, STELLARIS 5)下用明场及荧光观察样本并拍照记录。
1.7 斑马鱼hsp70启动子报告基因构建
运用在线工具UCSC genome browse (http://www. genome.ucsc.edu)预测hsp70基因启动子序列。通过Methprimer-Design (http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi)软件进行预测hsp70基因启动子的CpG岛。使用AliBaba2.0 (http://gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/index.html)软件预测转录因子结合位点。根据启动子的自身序列以及所用载体pGL3-Enhancer设计引物, 并在正反引物前添加同源臂(表 1)。PCR反应所用模板为受精后1d的斑马鱼基因组, 将报告基因载体pGL3-Enhancer通过限制性内切酶Nhe Ⅰ和Xho Ⅰ进行双酶切。将PCR产物及线性化的载体进行纯化处理之后, 用同源重组连接酶ClonExpress Mix将这二者充分混合后并在PCR仪中进行50℃反应30min, 将连接产物冰浴反应5min加置DH5α感受态细胞内进行转化, 涂板挑选单个菌落, 扩摇后送测鉴定。
1.8 hsp70启动子报告基因的活性检测
HEK293T细胞置于24孔细胞培养板培养, 铺板时计算细胞密度, 1.0×105个细胞/孔, 24h后融合率达到70%—80%即可进行转染。按体系(表 2)转染24h后用双荧光素酶报告基因实验分析hsp70启动子活性。
表 2 hsp70报告基因活性检测转染体系Table 2. Transfection system for detecting hsp70 promoter reporter gene activity组别
GrouppGL3-
Enhancer (ng)pGL3-hsp70-
pro (ng)pRL-
TK (ng)1 200 0 20 2 0 200 20 1.9 检测notch1a、notch1b对hsp70作用
HEK293T细胞置于24孔细胞培养板培养, 铺板时计算细胞密度, 1.0×105个细胞/孔, 24h后融合率达到70%—80%即可进行转染。将内参质粒pRL-TK、pCMV-N1aICD、pCMV-N1bICD和pGL3-hsp70-pro, 配制转染体系后按不同分组(表 3)将转染复合物加入到24孔板的HEK293T细胞中, 过表达notch1a和notch1b基因24h后检测hsp70启动子活性。
表 3 转染复合物配制表Table 3. Formulation table of transfected compound组别
GrouppCMV-
Tag2B (ng)N1aICD
(ng)N1bICD
(ng)pGL3-hsp70-
pro (ng)pRL-TK
(ng)1 200 0 0 100 10 2 0 200 0 100 10 3 0 0 200 100 10 每组有3次技术重复, 实验重复3次, 结果用平均值±标准误(mean±SE)表示, 用Prism 6.0软件进行显著性差异分析, P<0.05时, 认为具有显著性差异。
2. 结果
2.1 斑马鱼notch1a、notch1b基因系统发育分析
通过DNAMAN软件将斑马鱼Notch1a及Notch1b氨基酸序列与人(Homo sapiens)和小鼠(Mus musculus)的Notch1氨基酸序列进行比对, 斑马鱼的Notch1a氨基酸序列与人(NP_060087.3)和小鼠(NP_032740.3)的Notch1的一致性分别为66.86%和64.41%, Notch1b氨基酸序列与人和小鼠的Notch1的一致性分别为67.67%和67.72%, 斑马鱼Notch1a及Notch1b氨基酸序列的一致性为68.72%(表 4)。
表 4 斑马鱼Notch1a、Notch1b和人、小鼠Notch1氨基酸相似性分析(%)Table 4. Amino acid similarity analysis of zebrafish Notch1a, Notch1b, human and mouse Notch1 (%)物种
Species斑马鱼
Danio rerio人
Homo sapiens小鼠
Mus musculusNotch1a Notch1b Notch1 Notch1 斑马鱼
Danio
rerioNotch1a 100.00 68.72 66.86 64.41 Notch1b 68.72 100.00 67.67 67.72 为了分析斑马鱼notch1a和notch1b基因的系统进化关系, 本研究通过MEGA 7.0软件中的邻接法比对相应序列, 将斑马鱼中的Notch1a和Notch1b氨基酸序列与哺乳类、鸟类及其他鱼类等相关物种的Notch1氨基酸序列进行比对, 构建进化树(图 2)。结果表明斑马鱼与鲤(Cyprinus carpio)、鲫(Carassius auratus)等鲤科鱼类进化距离最近, 鱼类中斑马鱼与其他硬骨鱼类的Notch1a和Notch1b各自聚为一支, 哺乳动物和鸟类的Notch1形成各自的分支。
2.2 斑马鱼pCMV-N1aICD和pCMV-N1bICD真核表达载体的构建及验证
克隆出斑马鱼notch1a和notch1b基因的胞内段后进行电泳(图 3A), 其中notch1a胞内段序列长度为2067 bp, notch1b胞内段序列长度为2196 bp, 将PCR产物进行纯化处理后与双酶切线性化后的pCMV-Tag2B载体用T4连接酶进行了连接, 测序验证构建质粒与预测结果一致。
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图 3 pCMV-N1aICD和pCMV-N1bICD真核表达载体的构建及验证M1. DL5000 DNA Marker; 1. notch1a基因胞内段; 2. notch1b基因胞内段; M2. 蛋白分子量标准; 3. pCMV-Tag2B; 4. pCMV-N1aICD; 5. pCMV-N1bICDFigure 3. Construction and validation of pCMV-N1aICD and pCMV-N1bICD eukaryotic expression vectorsM1. DL5000 DNA Marker; 1. N1aICD; 2. N1bICD; M2. protein marker; 3. pCMV-Tag2B; 4. pCMV-N1aICD; 5. pCMV-N1bICD为验证重组质粒在细胞中的表达情况, 我们用pCMV-Tag2B和重组质粒转染HEK293T细胞24h培养后, 提取细胞内的总蛋白, 通过Western Blot利用鼠源FLAG-tag标签特异性抗体进行检测, 发现了特异性目的条带的表达(图 3B), 而转染pCMV-Tag2B的对照组未检测出目的蛋白。将重组质粒命名为pCMV-N1aICD(图 3C)和pCMV-N1bICD(图 3D)。
2.3 亚细胞定位检测N1aICD和N1bICD的表达位置
为确认重组质粒pCMV-N1aICD和pCMV-N1bICD在细胞中的表达位置, 我们用DAPI试剂对HEK293T细胞染色, 使细胞核能发出蓝色荧光, FLAG抗体标记重组质粒(绿色荧光), 并对细胞分别进行了明场和荧光观察, 同时pCMV-Tag2B质粒用作阴性对照, 能够观察到N1aICD和N1bICD在HEK293T细胞核中正常表达(图 4)。
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图 4 N1aICD和N1bICD在HEK293T细胞中的定位Figure 4. Localization of N1aICD and N1bICD in HEK293T cells2.4 斑马鱼hsp70启动子序列分析结果
通过Methprimer-Design软件预测发现斑马鱼hsp70启动子上同时存在2个CpG岛(图 5A)。使用AliBaba软件系统预测发现斑马鱼hsp70启动子上存在NF-1、NF-kappaB、Oct-1、Sp-1、GATA-1和HSF等重要的转录因子结合位点(图 5B)。
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图 5 斑马鱼hsp70启动子CpG岛和转录因子结合位点的预测Figure 5. Prediction of CpG island and transcription factor binding sites in zebrafish hsp70 promote2.5 hsp70启动子报告基因的构建及活性检测
克隆hsp70启动子片段后进行电泳(图 6A), 获得hsp70启动子序列长度为3173 bp的条带, 将PCR产物进行纯化处理后与双酶切后的线性化载体pGL3-Enhancer连接, 测序检验克隆成功。将pGL3-hsp70-pro报告基因转染HEK293T细胞, 对照组转染pGL3-Enhancer, 24h后进行双荧光素酶报告基因活性检测。检测结果显示pGL3-hsp70-pro活性为对照组质粒的3.7倍(图 6B), 说明构建的斑马鱼pGL3-hsp70-pro报告基因具有转录活性。
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图 6 pGL3-hsp70-pro报告基因的构建及活性检测M. DL5000 DNA Marker; 1. hsp70启动子的扩增; **表示与对照组有极显著性差异(P<0.01)Figure 6. Construction and activity detection of pGL3-hsp70-pro reporter geneM. DL5000 DNA Marker; 1. cloning of hsp70 promoter; ** means very significant difference compare with the control (P<0.01)2.6 斑马鱼notch1a和notch1b可促进hsp70启动子转录活性
将构建好的pCMV-N1aICD和pCMV-N1bICD质粒分别与pGL3-hsp70-pro质粒共同转染至HEK293T细胞中。在24h检测显示过表达notch1a后pGL3-hsp70-pro的报告基因转录活性为对照组的4.9倍, 过表达notch1b后pGL3-hsp70-pro的报告基因转录活性为对照组的5.1倍, 二者均对pGL3-hsp70-pro报告基因有显著的促进作用(图 7)。
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图 7 验证N1aICD和N1bICD 对pGL3-hsp70-pro转录活性的影响**表示与对照组有极显著性差异(P<0.01); 1. pCMV-Tag2B+pGL3-hsp70-pro; 2. pCMV-N1aICD+pGL3-hsp70-pro; 3. pCMV-N1bICD+ pGL3-hsp70-proFigure 7. Verification the effects of N1aICD and N1bICD on pGL3-hsp70-pro transcriptional activity**means very significant difference compare with the control (P<0.01); 1. pCMV-Tag2B+pGL3-hsp70-pro; 2. pCMV-N1aICD+pGL3-hsp70-pro; 3. pCMV-N1bICD+pGL3-hsp70-pro3. 讨论
目前在斑马鱼DNA数据库中发现了bcl-2家族、凋亡诱导因子bax和caspase家族等几类细胞凋亡相关的基因[23], 在鱼类及哺乳动物细胞凋亡调节中都有各自的同源基因, 这表明斑马鱼和其他鱼类以及高等脊椎动物进化过程中大多数凋亡途径的分子机制是高度保守的[24], 因此斑马鱼已被广泛应用于研究胚胎发育、免疫应答及应激过程中的细胞凋亡。
Notch信号在许多物种中被发现是调节细胞命运的重要通路, Notch分子的结构和功能在不同物种间具有一定的保守性, 通过复杂的分子机制参与生物体细胞的凋亡和免疫功能[25]。在长期的进化过程中, 斑马鱼有notch1a和notch1b两个同源基因, 二者的氨基酸序列与人类Notch1的一致性分别高达66.86％和67.67％, 与小鼠Notch1的一致性分别高达64.41％和67.72％。在大鼠中胆碱可促进热休克转录因子HSF (Heat shock transcription factor, HSF)和Notch1胞内段的表达, 从而减轻药物诱导的大鼠心肌细胞凋亡[26]。Notch1的胞内段N1ICD被Nrf2启动子募集后进而激活Nrf2通路, 共同控制神经元细胞的分化和凋亡[27]。而鱼类Notch1a和Notch1b在细胞凋亡中的确切作用目前还知之甚少, 在本实验中以构建的斑马鱼pCMV-N1aICD和pCMV-N1bICD载体质粒作为研究工具, 发现两者的亚细胞定位均在细胞核中, 与哺乳动物中Notch1胞内段的亚细胞定位相一致, 推测他们可能具有哺乳动物Notch1的类似功能。
Hsp70作为抗凋亡蛋白在细胞中通过多种方式干扰细胞凋亡, 涉及鱼类对环境污染物和食物毒素的应激反应[28], 因此也被称为应激蛋白[29]。虹鳟(Oncorhynchus mykiss)应对热应激会通过上调Hsp70的表达来恢复受损蛋白质的结构, 抑制细胞凋亡来发挥抗热应激作用[30]。高温会导致暗纹东方鲀(Takifugu obscurus)血细胞产生内源性活性氧致使细胞凋亡, Hsp70可以重新组装变性的蛋白质并消除有毒的活性氧积累, 保护暗纹东方鲀免受氧化应激[31]。在皮质醇应激条件下, 海鲈(Perca fluviatilis)的头肾细胞高表达的Hsp70可以使细胞能够在损伤刺激中存活[32], 因此Hsp70对鱼类个体健康生长和维持自身免疫功能具有重要意义。本实验克隆了斑马鱼hsp70启动子, 用同源重组技术构建了pGL3-hsp70-pro报告基因载体, 在HEK293T细胞中检测其具有较高的活性, 且双荧光素酶报告基因系统研究结果表明, 斑马鱼分化出来的notch1a和notch1b对hsp70的转录活性均有促进作用, 而且二者对hsp70的调控作用相似, 可能共同参与了斑马鱼细胞凋亡的调控。在小鼠RAW 264.7巨噬细胞中发现Notch1可以激活NF-κB信号通路并参与调控巨噬细胞的凋亡[33]。本研究通过生信分析发现斑马鱼hsp70启动子上同样存在NF-κB等转录因子结合位点, 因此我们猜测斑马鱼Notch1a和Notch1b可能通过NF-κB途径进而影响hsp70, 这需要进一步的研究来证明, 希望我们构建的hsp70报告基因可以为后续探究该基因在鱼类免疫及抗凋亡信号通路中的具体机制提供帮助。
在养殖过程中鱼类容易接触环境中的重金属、病原菌和氨等不良因素, 而Hsp70已经被证明在鱼类及哺乳类免疫系统、细胞凋亡和炎症过程中具有非常重要的作用。本研究使用双荧光素酶报告基因系统, 在斑马鱼中发现notch1a和notch1b对hsp70具有正向调控作用, 实验结果可以为后续进一步研究鱼类不同信号途径在细胞凋亡和免疫应答中的作用机制提供帮助, 对其他经济鱼类的细胞凋亡调控、抵抗病原感染及绿色生物制剂的开发提供了新的靶点。
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图 1 斑马鱼Notch1a和Notch1b结构示意图
NECD. 胞外结构域; TM. 跨膜域; NICD. 胞内段
Figure 1. Structure diagram of zebrafish Notch1a and Notch1b
NECD. Notch extracellular domain; TM. Transmembrane domain; NICD. Notch intracellular domain
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图 3 pCMV-N1aICD和pCMV-N1bICD真核表达载体的构建及验证
M1. DL5000 DNA Marker; 1. notch1a基因胞内段; 2. notch1b基因胞内段; M2. 蛋白分子量标准; 3. pCMV-Tag2B; 4. pCMV-N1aICD; 5. pCMV-N1bICD
Figure 3. Construction and validation of pCMV-N1aICD and pCMV-N1bICD eukaryotic expression vectors
M1. DL5000 DNA Marker; 1. N1aICD; 2. N1bICD; M2. protein marker; 3. pCMV-Tag2B; 4. pCMV-N1aICD; 5. pCMV-N1bICD
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图 4 N1aICD和N1bICD在HEK293T细胞中的定位
Figure 4. Localization of N1aICD and N1bICD in HEK293T cells
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图 5 斑马鱼hsp70启动子CpG岛和转录因子结合位点的预测
Figure 5. Prediction of CpG island and transcription factor binding sites in zebrafish hsp70 promote
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图 6 pGL3-hsp70-pro报告基因的构建及活性检测
M. DL5000 DNA Marker; 1. hsp70启动子的扩增; **表示与对照组有极显著性差异(P<0.01)
Figure 6. Construction and activity detection of pGL3-hsp70-pro reporter gene
M. DL5000 DNA Marker; 1. cloning of hsp70 promoter; ** means very significant difference compare with the control (P<0.01)
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图 7 验证N1aICD和N1bICD 对pGL3-hsp70-pro转录活性的影响
**表示与对照组有极显著性差异(P<0.01); 1. pCMV-Tag2B+pGL3-hsp70-pro; 2. pCMV-N1aICD+pGL3-hsp70-pro; 3. pCMV-N1bICD+ pGL3-hsp70-pro
Figure 7. Verification the effects of N1aICD and N1bICD on pGL3-hsp70-pro transcriptional activity
**means very significant difference compare with the control (P<0.01); 1. pCMV-Tag2B+pGL3-hsp70-pro; 2. pCMV-N1aICD+pGL3-hsp70-pro; 3. pCMV-N1bICD+pGL3-hsp70-pro
表 1 实验所用引物序列
Table 1 Primer sequence used in the experiment
引物名称
Primer name序列
Sequence (5′—3′)用途
Usagenotch1a-F1 GGCCTCCAGTGGAAACCT CDS 序列扩增
Amplification of CDS sequencesnotch1a-R1 CTACTTGAAGGCTTCTGGAATATG notch1b-F1 CAAAGGCTCCGTGGTTTAT notch1b-R1 AAGCAGGCTTATGGAATGTG notch1a-F2 CGCGGATCCTCCAGGAAGAGGAAGCGGG 表达载体构建
Construction of expression vectornotch1a-R2 CCCAAGCTTCTTGAAGGCTTCTGGAATATGGTTCATC notch1b-F2 CGCGGATCCTCCCGTAAACGGCGCCG notch1b-R2 CCCAAGCTTCTTGAATTGCTCGGGCATGTG hsp70-F CGAGCTCTTACGCGTGCTAGCTGAAGTGGACGGATTGAGTGA 报告基因载体构建
Construction of reporter gene vectorhsp70-R ACTTAGATCGCAGATCTCGAGAAACACCTCGTCGGGGAAAA 
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表 2 hsp70报告基因活性检测转染体系
Table 2 Transfection system for detecting hsp70 promoter reporter gene activity
组别
GrouppGL3-
Enhancer (ng)pGL3-hsp70-
pro (ng)pRL-
TK (ng)1 200 0 20 2 0 200 20
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表 3 转染复合物配制表
Table 3 Formulation table of transfected compound
组别
GrouppCMV-
Tag2B (ng)N1aICD
(ng)N1bICD
(ng)pGL3-hsp70-
pro (ng)pRL-TK
(ng)1 200 0 0 100 10 2 0 200 0 100 10 3 0 0 200 100 10
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表 4 斑马鱼Notch1a、Notch1b和人、小鼠Notch1氨基酸相似性分析(%)
Table 4 Amino acid similarity analysis of zebrafish Notch1a, Notch1b, human and mouse Notch1 (%)
物种
Species斑马鱼
Danio rerio人
Homo sapiens小鼠
Mus musculusNotch1a Notch1b Notch1 Notch1 斑马鱼
Danio
rerioNotch1a 100.00 68.72 66.86 64.41 Notch1b 68.72 100.00 67.67 67.72
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