REGULATION OF HSP70 GENE BY NOTCH1A AND NOTCH1B IN ZEBRAFISH (DANIO RERIO)
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摘要:
研究旨在通过双荧光素酶报告基因实验探究斑马鱼notch1a和notch1b基因对hsp70的调控作用。通过NCBI数据库检索获取了斑马鱼notch1a和notch1b基因的CDS序列, 对其胞内段(Notch1a/Notch1b intracellular domain, N1aICD/N1bICD)进行克隆并构建pCMV-N1aICD和pCMV-N1bICD真核表达载体, 在人胚肾细胞(HEK293T)中用Western Blot和亚细胞定位检测N1aICD和N1bICD的表达。通过生信分析并克隆斑马鱼hsp70启动子序列, 构建pGL3-hsp70-pro报告基因, 并在HEK293T中检测该报告基因的双荧光素酶活性。之后在HEK293T细胞中过表达notch1a和notch1b基因, 通过双荧光素酶报告基因实验检测pGL3-hsp70-pro的活性变化, 以此探究notch1a和notch1b对hsp70基因的调控作用。实验结果显示真核表达载体pCMV-N1aICD和pCMV-N1bICD构建成功, Western Blot显示pCMV-N1aICD和pCMV-N1bICD可正常表达, 亚细胞定位显示N1aICD和N1bICD蛋白表达在HEK293T的细胞核中; 双荧光素酶实验显示pGL3-hsp70-pro报告基因在HEK293T细胞中具有活性, 是阴性对照质粒的3.7倍; 在HEK293T细胞中pCMV-N1aICD和pCMV-N1bICD真核表达载体能够显著增强pGL3-hsp70-pro的活性, 分别为对照组的4.9倍和5.1倍。实验结果表明斑马鱼 notch1a和notch1b基因可显著增强hsp70基因的表达, 为进一步研究Notch分子通过Hsp70进行抗感染免疫的分子机制提供了实验材料并奠定了理论基础。
Abstract:The aim of this study was to investigate the regulatory role of zebrafish (Danio rerio) notch1a and notch1b genes on hsp70 by using a dual luciferase reporter gene assay. The CDS sequences of zebrafish notch1a and notch1b genes were obtained through NCBI database search, and their intracellular domains (Notch1a/Notch1b intracellular domain, N1aICD/N1bICD) were cloned. Eukaryotic expression vectors, pCMV-N1aICD and pCMV-N1bICD, were constructed. The expressions of N1aICD and N1bICD were detected in human embryonic kidney cells (HEK293T) through Western Blot and subcellular localization. The zebrafish hsp70 promoter sequence was analyzed, cloned, and incorporated into the pGL3-hsp70-pro reporter gene, which was constructed and assayed for dual luciferase activity in HEK293T. Overexpression of notch1a and notch1b genes in HEK293T cells was performed, and changes in pGL3-hsp70-pro activity were detected using a dual-luciferase reporter gene assay. The results showed that the successful construction of eukaryotic expression vectors pCMV-N1aICD and pCMV-N1bICD. Western Blot analysis confirmed the normal expression of pCMV-N1aICD and pCMV-N1bICD, while the subcellular localization assay showed the normal expression in the nucleus of HEK293T cells. The dual-luciferase reporter gene showed that the pGL3-hsp70-pro reporter gene was active in HEK293T cells, exhibiting activity 3.7 times higher than that of the empty plasmid. Additionally, the pCMV-N1aICD and pCMV-N1bICD eukaryotic expression vectors significantly enhanced the activity of pGL3-hsp70-pro in HEK293T cells, showing increases of 4.9-fold and 5.1-fold compared to the control, respectively. The results indicated that zebrafish notch1a and notch1b genes play a substantial role in enhancing the expression of hsp70 gene. This provides experimental materials and a theoretical foundation for further investigation into the immune mechanism of Notch molecular in defense against infection and apoptosis through Hsp70.
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Keywords:
- notch1a /
- notch1b /
- hsp70 /
- Luciferase /
- Apoptosis /
- Danio rerio
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鳜属于鲈形目(Perciformes), 鳜亚科(Sinipercidaedae), 鳜属(Siniperca), 别名鳜鱼、桂花鱼等, 集中分布于我国东部平原地区[1]。鳜作为我国极具发展潜力的淡水养殖品种, 能够带来良好的经济效益, 具有极大推广价值。随着鳜驯食人工饲料瓶颈的逐步突破, 近年来其饲料研发领域取得了显著进展.使用人工饲料投喂鳜鱼能够大幅降低养殖过程中的人力成本、饵料鱼需求、药物使用及管理开支, 进而显著提高养殖户的收益水平[2]。但目前鳜饲料配方仍需优化改良, 饲料鳜的养殖过程中常出现生长性能不佳、代谢障碍如肝脏损伤, 免疫力下降等问题。因此, 研发高效优质的鳜饲料十分必要。
饲料中蛋白质不足时, 鱼类会消耗非必要组织中的蛋白质, 用以维持更重要组织的正常功能, 从而导致生长受阻和体质量降低[3]。而鱼类对于蛋白质的营养需要, 实质反映在对于必需氨基酸的需求上。亮氨酸(Leucine, Leu)作为优质蛋白质资源中的支链氨基酸(Branched chain amino acid, BCAA)之一, 是机体无法合成而须由食物蛋白提供的必需氨基酸(EAA), 具有调节蛋白质、碳水化合物和脂类代谢、提供能量、增强免疫力、减少负氮平衡、调控mRNA翻译起始等重要功能, 从而影响营养物质代谢和动物生长[4]。饲料中添加最适水平的Leu能够增加动物生长激素的分泌, 同时调节相关基因的表达, 进而促进动物生长[5]。在水产动物中也有许多对于亮氨酸的需要量的研究, 包括金鲳(Trachinotus ovatus)[6]、异育银鲫(Carassius auratus gibelio var. CAS III)[7]、草鱼(Ctenopharyngodon idellus)[8]、大黄鱼(Pseudosciaena crocea)[9]、日本鲈(Lateolabrax japonicus)[10]等。研究表明最佳日粮Leu水平对促进异育银鲫肌肉蛋白沉积、增强抗氧化酶活性和提高非特异性免疫均产生显著影响[7]。此外, 饲料Leu含量不足或过多均会对鱼类的生长性能产生不利影响[11, 12]。Liang等[13]发现补充适量Leu可以通过调节超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷甘光肽过氧化物酶(GPx)活性、总抗氧化能力(T-AOC)活性、过氧化氢酶(CAT)活性、活性和丙二醛(MDA)含量, 显著增强团头鲂(Megalobrama amblycephala)的抗氧化能力。最佳日粮Leu水平还能够调节草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肠道的免疫状态和免疫相关信号分子[8]。亮氨酸作为免疫细胞的主要能量来源, 缺乏时会导致免疫细胞功能受损, 从而降低鱼类的抗病力[12]。Konashi[14]等发现Leu摄入不足可能会导致机体免疫能力下降。因此, 确定鱼类最适Leu水平及其营养生理作用具有重大意义。
目前还未发现有关鳜对饲料Leu需求量及Leu对鳜幼鱼阶段抗氧化能力、鳜肝脏健康和非特异性免疫功能影响的研究。因此, 本研究的首要目的是研究鳜饲料Leu的最佳水平, 其次是通过分析不同Leu水平对鳜抗氧化酶活性、免疫相关基因表达水平的影响, 探讨饲料Leu水平对鳜的生长、抗氧化能力、肝脏健康和非特异性免疫的影响。本研究可为鳜的饲料养殖, 以及饲料配方的优化提供一定的理论基础。
1. 材料与方法
1.1 实验饲料的配置
本实验以鱼粉、发酵豆粕作为主要蛋白源, 以鱼油和豆油为脂肪源, 氨基酸预混料配方参照鳜肌肉的氨基酸组成[15], 以0.6%为梯度, 在基础饲料水平上添加晶体L-亮氨酸, 以等量L-谷氨酸、L-天冬氨酸作为其等氮替代物, 制备了6组等氮等能的实验饲料。六组饲料的Leu含量分别为1.88%、2.49%、3.13%、3.73%、4.29%和4.90% (表 1), 对应处理组为L1.88、L2.49、L3.13、L3.73、L4.29和L4.90。实验饲料原料通过粉碎机充分粉碎后经80目筛, 经搅拌机搅拌混匀, 通过饲料机将饲料制成直径0.5 cm, 长度为1 cm的圆柱体软颗粒饲料, 自然风干后装袋储存在–20℃的冰箱中直至使用。
表 1 实验饲料配方及其营养组成Table 1. Formulation and proximate composition of the experimental diets (%)实验原料Ingredient 饲料编号Diet number L1.88 L2.49 L3.13 L3.73 L4.29 L4.90 进口白鱼粉Fish meal 20.0 20.0 20.0 20.0 20.0 20.0 发酵豆粕Casein 15.0 15.0 15.0 15.0 15.0 15.0 α-淀粉α-starch 8.0 8.0 8.0 8.0 8.0 8.0 进口鱼油Fish oil 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 大豆油Soybean oil 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 维生素预混料Vitamin premixa 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 矿物质预混料Mineral premixb 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 氨基酸预混料Amino acid premixc 19.5 19.5 19.5 19.5 19.5 19.5 微晶纤维素Cellulose 16.5 16.5 16.5 16.5 16.5 16.5 羧甲基纤维素钠Carboxymethylcellulose sodium 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 谷氨酸Glutamic acid 3.0 2.7 2.4 2.1 1.8 1.5 天冬氨酸Aspartic acid 3.0 2.7 2.4 2.1 1.8 1.5 亮氨酸Leucine 0.0 0.6 1.2 1.8 2.4 3.0 组成成分Composition 亮氨酸Leucine 1.88 2.49 3.13 3.73 4.29 4.90 粗蛋白Crude protein 47.50 47.20 47.40 47.40 47.40 47.40 粗脂肪Crude lipid 11.30 11.50 11.20 11.20 11.20 11.20 粗灰分Crude ash 18.20 18.10 18.30 18.30 18.30 18.30 注: a维生素预混料(mg/kg 饲料): 胆碱1000, 肌醇600, 维生素A 40, 维生素D 0.06, 维生素E 200, 维生素K 10, 硫胺素15, 核黄素25, 维生素B6 20, 泛酸50, 烟酸200, 生物素3.2, 维生素B12 0.1, 叶酸10, 维生素C 210; b矿物质预混料(mg/kg 饲料): 磷酸氢钙15000, 氯化钾3000, 硫酸镁800, 氯化钠1500, 五水硫酸铜10, 硫酸亚铁150, 硫酸锌80, 硫酸锰13, 亚硒酸钠0.7, 碘化钾1.1, 钼酸钠0.14, 硫酸钴0.02, 氟化钾0.26. c氨基酸预混料(mg/kg 饲料): 赖氨酸38.21, 苏氨酸17.47, 蛋氨酸8.98, 异亮氨酸14.64, 缬氨酸15.34, 苯丙氨酸17.44, 酪氨酸11.27, 组氨酸13.13, 精氨酸17.61, 丙氨酸2.06, 甘氨酸9.05, 丝氨酸11.26Note: aThe vitamin premix (mg/kg diet): choline 1000; inositol 600; vitamin A 40; vitamin D 0.06; vitamin E 200; vitamin K3 10; vitamin B1 (thiamin) 15; vitamin B2 (riboflavin) 25; vitamin B6 20; pantothenic acid calcium 50; niacinamide 200; biotin 3.2; vitamin B12 0.1; folic acid 10; ascorbic acid 210; bThe mineral premix (mg/kg diet): CaHPO4 15000; KCl 3000; MgSO4 800; NaCl 1500; CuSO4·5H2O 10; FeSO4 150; ZnSO4 80; MnSO4 13; Na2SeO3 0.7; KI 1.1; Na2MoO4 0.14; CoSO4 0.02; KF 0.26; cAmino acid premix (mg/kg diet): Lysine 38.21, threonine 17.47, methionine 8.98, isoleucine 14.64, valine 15.34, phenylalanine 17.44, tyrosine 11.27, Histidine 13.13, arginine 17.61, alanine 2.06, glycine 9.05, serine 11.26 1.2 实验动物和饲养实验
实验用鳜来自农业部鳜鱼育种创新基地(中国, 武汉), 正式实验开始前, 将鳜置于室内循环水大缸(3000L)中暂养, 暂养期间鳜按特定驯食程序用人工饲料驯化17d以适应饲料和实验室条件[16]。驯化期结束后, 饥饿24h, 随机挑选216尾整齐健康的鳜[平均体重为(37.26±0.22)g]放入室内循环水养殖缸中养殖, 将鳜随机分成6组(设3个平行), 各缸(600 L)中放入18尾鳜。养殖周期为8周。养殖期间每日于08:00和17:00各饱食投喂1次, 餐后及时清饵吸污。系统使用过滤后的自来水, 水流量为3 L/min。在整个实验过程中, 溶解氧值为(8.25—8.76) mg/L, 温度范围为(20—22)℃, 氨氮含量<0.20 mg/L, pH为7.20—7.60。
1.3 样品采集
饲养实验8周后对实验鱼禁食24h。采用MS-222 (75 mg/L)麻醉, 测量各组鳜的体重。每缸随机取6尾鱼用于全鱼体成分分析。每缸随机取6尾鱼采血, 采用尾静脉采血法, 血液在4℃下中静置4h后, 以3000 r/min离心15min, 离心后取出血清用于血清免疫指标测定, 采血后立即取内脏团和肝脏称重, 用于计算脏体指数和肝体指数, 之后迅速将肝组织在液氮中冷冻, 一部分用于营养成分分析, 一部分用于抗氧化酶活性测定, 测定前准确称取(0.1—0.2) g肝组织在预冷处理的生理盐水中洗净, 用滤纸吸干表面生理盐水。添加9倍于组织重量的生理盐水后超声匀浆破碎, 随后将组织样品置于4℃预冷离心机中, 以2800 r/min离心15min, 取上清液制备肝匀浆液, 还有一部分用于随后的RNA提取。
1.4 指标测定与测定方法
生长指标计算 增重率(WGR, %)=100×[(Wf–Wi)/Wi], 式中Wf为最终体重, Wi为初始体重;
特定生长率(SGR, %/d)=100×(lnWf–lnWi)/t, 式中t为实验天数;
饵料系数(FCR, %)=100×WF/(Wf–Wi), 式中WF为摄食量;
肝体指数(HSI, %)=100×Wh/Wq, 式中Wh为肝重, Wq为全体重;
脏体指数(VSI, %)=100×Wv/Wq, 式中Wv为内脏重量。
常规营养成分分析 饲料原料, 全鱼和肝脏样品的水分、蛋白质、脂肪参照AOAC的分析方法进行[17]。饲料中亮氨酸水平采用GB/T18246-2000进行检测。用凯氏定氮仪测定样品含氮量, 换算得到样品粗蛋白含量; 样品的粗脂肪含量使用索氏提取器用乙醚萃取测定。样品经60℃干燥12h后, 再经105℃干燥6h, 准确称量干燥前后样品重量, 测定样品含水量。
肝脏抗氧化酶活性和血清生化指标测定 肝组织抗氧化酶活性测定包括超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)酶活性, 测定均使用南京建城生物工程研究所对应检测试剂盒, 根据相应试剂盒的说明执行测试步骤。
血清生化指标测定包括补体成分3 (C3)含量、溶菌酶(LYZ)、丙氨酸氨基转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)和碱性磷酸酶(ALP)活性, 测定均使用南京建成生物工程研究所对应检测试剂盒, 按照试剂盒说明书执行测试步骤。
免疫基因表达 根据实验室鳜鱼基因组数据库中搜索到的基因序列, 采用Primer Premier 5.0软件进行荧光定量PCR引物设计白细胞介素1β (il-1β)、肿瘤坏死因子α (tnf-α)、核因子κB p65 (nf-κb p65)和纤溶酶原激活物抑制物(pai)等基因序列, 引物序列见表 2。引物由上海生工生物技术有限公司合成。利用Trizol试剂法提取肝脏总RNA。用1%的琼脂糖凝胶检测RNA完整性。参照TaKaRa反转录试剂盒说明书操作得到cDNA。在赛默飞荧光定量PCR仪上进行实时荧光定量PCR测定, 反应总体系为20 μL, 包括2×Taq master mix (TaKaRa)10 μL, Primer F, 0.8 μL; Primer R, 0.8 μL; RNase free water, 8 μL; cDNA模板, 0.4 μL。Rpl13a为内参基因, 基因表达水平使用2–ΔΔCt法计算。
表 2 实时荧光定量的引物序列Table 2. Primer sequences used for RT-PCR基因名称 Gene 引物序列5′—3′
primer sequence 5′—3′rpl13a CACCCTATGACAAGAGGAAGC
TGTGCCAGACGCCCAAGnf-κb p65 ACCACTAAGACCCACCCA
CAAACTCCTCCTCCCACApai GCAAGGAACTAAGGGAG
GTGTTTGTGCTGGACGAtnf-α GAACGATGACGCCAAGA
AGGGCAAACACACCAAAil-1β TGACTGACAGCAAGAAGAGG
TTGTGGCAAGACAGGTAGAG1.5 数据统计分析
实验数据采用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析(ANOVA)。结果以平均值±标准误(mean±SE)表示。采用Duncan方法进行多重比较, P<0.05认为有统计学意义。
2. 结果
2.1 生长性能
鳜幼鱼在投喂不同Leu水平饲料下的生长性能以及饲料利用能力见表 3, 不同Leu水平的饲料可对鳜的生长性能产生显著影响。随着Leu水平的提高, 终末体重、WGR及SGR均呈现先上升后下降的趋势, 当Leu水平达到3.13%时, 终末体重、WGR和SGR都达到最大值, 均显著高于L1.88、L2.49、L4.29、L4.90组(P<0.05)。Leu3组饵料系数最小, 并显著低于L1.88、L2.49、L4.29 和L4.90组(P<0.05)。VSI和HSI随Leu水平的上升而上升。
表 3 饲料亮氨酸水平对鳜生长性能的影响Table 3. Effects of dietary leucine levels on the growth indices of Siniperca chuatsi (n=6)生长性能Growth index L1.88 L2.49 L3.13 L3.73 L4.29 L4.90 初始体重IBW (g) 36.97±0.47 36.88±0.18 37.56±0.38 37.44±0.36 37.74±0.18 37.02±0.23 终末体重FBW (g) 69.75±0.40c 73.83±0.58b 77.94±1.33a 75.31±1.02ab 73.23±0.92b 68.93±0.72c 增重率WGR (%) 88.68±1.39d 100.21±1.62b 107.50±1.47a 101.18±2.17b 94.02±1.67c 86.18±1.03d 特定生长率SGR (%/d) 0.82±0.03d 0.97±0.02c 1.16±0.03a 1.07±0.02ab 0.92±0.01c 0.79±0.01d 饲料系数FCR 1.78±0.04a 1.56±0.04bc 1.44±0.03d 1.47±0.04cd 1.58±0.02bc 1.67±0.04ab 肝体比HSI 10.66±0.36c 11.41±0.19c 12.80±0.36b 13.04±0.37b 13.49±0.38b 15.10±0.46a 脏体比VSI 1.67±0.13d 1.90±0.11cd 2.25±0.13ab 2.09±0.03bc 2.17±0.05bc 2.51±0.13a 注: 同行不同上标字母表示各组间差异显著(P<0.05); 下同Note: Different superscript letters in the same row indicate significantly differences(P<0.05). The same applies below 2.2 鱼体成分
幼鱼饲喂不同Leu水平饲料的体成分组成见表 4。结果表明, 饲料Leu水平对鱼体粗蛋白质、粗脂肪的含量产生显著影响(P<0.05)。当Leu水平为1.88%时, 鱼体粗蛋白质、粗脂肪含量最低。随着Leu含量从1.88%增加到3.13%, 鱼体粗蛋白和粗脂肪含量显著增加(P<0.05), 而在3.13%—4.29%水平上保持稳定(P>0.05), 随着Leu水平进一步增加, 鱼体粗蛋白和粗脂肪含量显著减少(P<0.05)。当Leu水平为3.13%和4.29%时, 肝脏粗蛋白含量显著增加(P<0.05)。
表 4 饲料亮氨酸水平对鳜体成分的影响Table 4. Effects of dietary leucine levels on the body composition of Siniperca chuatsi (n=3)营养成分
Nutritional componentL1.88 L2.49 L3.13 L3.73 L4.29 L4.90 全鱼Whole body 水分Moisture 75.19±0.20 75.26±0.26 75.13±0.39 75.02±0.16 74.98±0.16 75.01±0.08 粗蛋白Crude protein 11.96±0.09c 13.13±0.31b 14.73±0.11a 14.50±0.29a 14.39±0.27a 13.39±0.22b 粗脂肪Crude lipid 3.93±0.15c 4.74±0.25b 6.20±0.09a 6.33±0.24a 6.22±0.23a 5.83±0.23a 肝脏Liver 水分Moisture 80.59±0.31 79.82±0.26 80.09±0.44 79.55±0.41 80.32±0.24 80.63±0.38 粗蛋白Crude protein 14.38±0.26a 14.62±0.11a 17.44±0.09b 15.91±0.17ab 16.88±0.15b 14.54±0.20a 粗脂肪Crude lipid 5.34±0.14 5.76±0.16 5.19±0.22 5.33±0.13 5.55±0.12 5.67±0.15 以饲料Leu水平为横坐标, 鳜的WGR为纵坐标, 进行二次曲线回归分析, 得到回归方程为y=–7.6097x2+49.853x+22.839(R2=0.848), 回归曲线如图 1所示。以WGR为基础确定的最适饲料Leu水平为3.28%。
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图 1 鳜增重率与饲料中亮氨酸水平的二次回归分析图Xopt表示增重率最大时饲料亮氨酸的水平Figure 1. Relationship between WGR and dietary Leucine levels of groups based on quadratic polynomial regression analysisXopt represent the optimal dietary Leucine level for the maximum WGR2.3 肝脏抗氧化酶活性
不同Leu水平饲料对鳜肝脏中抗氧化酶活性的影响见表 5, Leu含量对CAT活性无显著性影响(P>0.05), 随着Leu水平的升高, 鳜肝脏中SOD、GSH-Px活性先上升后下降, 均在L1.88组最低。L3.13组SOD、GSH-Px活性与L3.73组差异不显著(P>0.05), 但都显著高于其余各组(P<0.05)。
表 5 饲料亮氨酸水平对鳜肝脏抗氧化酶活性的影响Table 5. Effects of dietary leucine levels on the activity of antioxidant enzymes in the liver of Siniperca chuatsi (U/mg prot, n=3)指标Index L1.88 L2.49 L3.13 L3.73 L4.29 L4.90 超氧化物歧化酶SOD 11.24±0.86c 14.33±0.42c 19.48±0.30a 18.80±0.30a 17.02±0.17b 15.51±0.69b 过氧化氢酶CAT 6.48±0.34 6.63±0.36 7.21±0.45 6.92±0.33 6.26±0.30 7.05±0.74 谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px 61.25±4.04d 69.38±2.18cd 105.33±8.70a 97.54±5.11ab 83.33±2.93bc 72.12±3.73cd 丙二醛MDA 14.44±1.03c 8.67±1.01ab 8.25±0.38a 11.49±1.26bc 10.08±0.39b 10.39±0.68b 2.4 亮氨酸水平对肝脏组织学的影响
由图 3可见, L3.13组和L3.73组细胞结构相对完整, 整体情况相对良好且肝细胞空泡化程度明显低于其余各组。L4.29组和L4.90组可观察到细胞膨大的现象, 同时L1.88组和L4.90组出现炎性细胞浸润现象。
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图 3 饲料亮氨酸水平对肝脏非特异性免疫相关基因mRNA表达水平的影响不同上标字母表示各组间差异显著(P<0.05)Figure 3. Effects of dietary leucine levels on the mRNA expression levels of nonspecific immunity relative genes in the liverDifferent superscript letters indicate significantly differences (P<0.05)2.5 血清生化指标
血清生化指标随饲料Leu含量的变化见表 6, 血清LYZ及C3含量随Leu水平的升高先上升后下降, 其中L3.73组LYZ活性最高, L3.13组C3含量最高, 但两组间差距不明显(P>0.05)。ALT、AST活性随着Leu含量升高(1.88%—3.13%)而显著降低(P<0.05), 在3.13%—4.29%水平保持相对稳定(P>0.05), 随后在L4.90组显著上升(P<0.05)。而饲料Leu水平对血清AKP的影响同ALT、AST规律类似, 但各组间无显著差异(P>0.05)。
表 6 饲料亮氨酸水平对鳜血清生化指标的影响Table 6. Effects of dietary leucine levels on the serum biochemical indices of Siniperca chuatsi (U/L, n=3)指标Index L1.88 L2.49 L3.13 L3.73 L4.29 L4.90 溶菌酶LYZ 4.71±0.11c 5.12±0.15c 8.04±0.29a 8.39±0.26a 6.74±0.28b 6.33±0.23b 补体成分3 C3 0.54±0.06d 0.68±0.05cd 0.95±0.04a 0.84±0.04ab 0.74±0.04bc 0.60±0.04cd 谷丙转氨酶ALT 35.82±0.82a 32.38±1.22bc 28.45±0.62d 29.15±0.48d 30.23±0.53cd 33.60±0.75ab 谷草转氨酶AST 46.52±1.17a 41.71±1.67b 25.36±1.49d 25.13±0.64d 28.10±1.06d 35.20±0.54c 碱性磷酸酶AKP 10.88±0.47 9.72±0.49 9.57±0.52 9.86±0.49 9.82±0.63 10.33±0.71 2.6 亮氨酸水平对免疫基因表达的影响
如图 2 所示, 肝脏中il-1β的mRNA相对表达量在L3.13组显著降低(P<0.05), 在L4.90组时显著上升(P<0.05), 且在3.13%—4.29%保持相对稳定(P>0.05)。与L1.88组和L4.90组相比, L3.13组nf-κb-p65的mRNA相对表达量最低, 与L3.73组没有显著性差异(P>0.05)。tnf-α的mRNA相对表达量在Leu水平为1.88%—3.13%显著降低(P<0.05), 随后保持稳定, 在Leu水平为4.29%时显著上升(P<0.05)。随着Leu含量升高, pai的mRNA相对表达量整体呈先下降后上升的趋势, 在L1.88组pai的mRNA相对表达量最高(P<0.05)。
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图 2 饲料亮氨酸水平对鳜肝脏形态的影响Figure 2. Effects of dietary leucine levels on liver morphology of Siniperca chuatsi3. 讨论
3.1 饲料亮氨酸水平对鳜生长性能影响
本研究结果显示, L1.88组和L4.90%组鳜WGR和SGR均有所降低, FCR有所提高, 说明Leu缺乏会导致鳜幼鱼生长迟缓, 而当饲料中Leu含量过高时, 超过了鱼体需要量, 反而对生长有抑制作用。而饲料中添加适宜水平的Leu可以显著性提高鳜幼鱼的WGR和SGR, 降低FCR。结果表明, 鳜具有利用饲料中添加的晶体Leu的能力。以增重率为评价指标, 鳜幼鱼对饲料Leu的最适需要量为3.28%, 占饲料蛋白质的6.92%。这一结果与金鲳[6](占饲料蛋白质的7.15%—8.02%)和大黄鱼[9](占饲料蛋白质的6.79%)的Leu需求量(占饲料蛋白质含量)相近, 高于日本鲈[10]的5.68%、斑点叉尾鮰[18](Ictalurus punctatus)的3.5%、团头鲂[13]的4.24%—4.34%和尼罗罗非鱼(Oreochromis nilotica)[19]的4.31%。而这些鱼类之间最适Leu需求产生差异的原因, 可能是因为不同鱼类的品种、鱼类的生长阶段、实验条件、饲料蛋白质的来源和含量、饲料蛋白质的氨基酸组成、水温、盐度及计算需求量的方式不同。本研究结果表明, 饲料Leu水平对鳜幼鱼肝脏及鱼体粗蛋白和粗脂肪有着显著影响, 这与金鲳[6]的研究结果相似; 适当的Leu添加改善了鳜体内的蛋白质和脂肪含量, 说明饲料中适宜的Leu对于体内营养物质的增加有益; 过低或过高的Leu水平均显著降低了鱼体及肝脏的蛋白质含量, 低水平Leu影响生长可能是由于氨基酸含量不平衡限制了蛋白质合成和代谢, 从而导致其生长性能下降; 研究表明, 摄入过量的三种BCAA或单独摄入过量的Leu, 都会导致机体正常氨基酸谱紊乱, 引起不良的生理效应, 如食欲减低、生长迟缓及进入脑组织的中性氨基酸减少等[20], 另一方面高水平Leu可能会和其他支链氨基酸(异亮氨酸和缬氨酸)之间产生拮抗作用[21], 从而对鳜氨基酸吸收、蛋白质合成和生长产生不利影响。这可能解释了Leu过量组生长性能下降的现象。
3.2 饲料亮氨酸水平对鳜抗氧化能力的影响
动物机体的抗氧化系统包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)构成的酶抗氧化系统, 以及维生素C、维生素E等物质组成的非酶抗氧化系统[22]。MDA是自由基与脂质发生过氧化反应的主要产物, SOD是体内清除活性氧的第一个酶, MDA和SOD含量间接反映了鱼体抗氧化能力的强弱[23]。SOD主要负责将O–2转化为H2O2, 从而确保细胞内氧化还原的保持稳定[24]。再由CAT和GSH-Px将产生的H2O2催化分解为H2O, 最终实现对体内活性氧的清除、保护细胞免受进一步的氧化损伤[25], 并且GSH-Px还具有清除其他有机氢过氧化物的能力[26]。Feng等[27]研究发现适宜Leu水平可以提高机体抗氧化能力, 通过提高抗氧化酶活性, 如T-AOC、SOD、CAT和GSH-Px等, 从而降低黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)体内脂质氧化。在三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)和团头鲂中的部分研究表明, 添加适宜水平的Leu可以提高水产动物机体抗氧化酶活性, 缓解机体氧化损伤[13, 28, 29]。在本研究中, 随着Leu水平的升高, 肝脏SOD和GPX-Px活性呈现先升高后降低的趋势, 且3.13%—3.73%组显著高于L1.88组和L4.90组。这说明过低或过高的Leu水平均显著降低肝脏的抗氧化能力, 其中, 过低的Leu水平可能无法满足鳜对这一必需氨基酸的需求, 从而可能影响其抗氧化酶活性和整体健康; 过高的Leu水平可能会导致鱼体氨基酸失衡, 破坏其他氨基酸的吸收与利用, 不利于体内酶的代谢, 导致抗氧化酶活性下降。而适当添加Leu可以激活鳜肝脏抗氧化系统, 通过增强抗氧化酶活性, 增强清除自由基的能力, 从而减轻环境胁迫的影响和应激反应。
3.3 饲料亮氨酸水平对肝脏健康的影响
鱼类的肝细胞排列紧密, 形状不规则。细胞形态会根据其内部物质的含量而改变。当肝细胞内脂肪滴较多时, 通常会导致细胞膨大。Choo等[30]发现对虹鳟(Oncorhynchus mykiss)饲喂过高Leu水平的饲料, 发现其肝细胞严重受到损失、肝细胞变大和细胞核变大且突出等症状。谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)作为氨基转氨酶, 在氨基酸代谢中发挥着不可忽视的作用, 同时在评估肝脏健康状况中作为重要依据[13]。本研究中血清AST、ALT水平均随着饲料Leu水平的增加先下降后上升, 说明Leu水平过低或过高均会引起鱼体代谢功能异常, 从而造成肝脏损伤, 而适宜的Leu水平可减少对肝脏造成的损伤。肝脏组织切片显示, 所有实验组的肝脏均表现出不同程度损伤, 这可能是由两个原因造成的, 一各方面是鳜作为典型肉食性鱼类对碳水化合物的利用能力很差[31], 本实验饲料中淀粉含量可能已经超过鳜鱼的淀粉耐受水平。另一个方面, 可能是实验饲料配方的主要营养元素配比和活性物质添加仍不够均衡。在本实验中, L4.29组和L4.90组可观察到细胞膨大且伴有空泡化的现象, 而当饲料中Leu水平为3.13%—3.73%时, 血清ALT和AST水平降低, 肝细胞的空泡化程度缓解, 肝细胞受损程度较轻, 两组鳜肝脏仍处于一个较为良性的健康状态, 说明适宜水平的Leu在提高肝脏健康有一定的作用。
3.4 饲料亮氨酸水平对血清生化指标和免疫基因表达的影响
碱性磷酸酶(AKP)水解许多有机化合物中的磷酸偶联胞外酶, 被认为与许多基本功能有关, 在体内直接参与磷酸基团的转移和代谢, 参与许多营养物质的吸收过程, 并被用作水生动物免疫的标志物[32, 33]。溶菌酶(LYZ)作为一种重要的免疫分子, 具有抗病毒、抗菌、抗炎等功能, 其水平可以反映免疫反应的变化, 并作为评估鱼类健康或疾病状况的诊断指标[34]。补体成分包括补体成分3 (C3)和补体成分9 (C9), 可以与膜攻击复合物结合并导致病原体的细胞裂解, 可作为反映机体非特异免疫能力的重要生化指标[35—37]。在本研究中, LYZ和C3的含量呈现先升高后降低的趋势, 适宜的饲料Leu水平(3.13%—3.73%)显著提高了LYZ和C3的含量, 这与在金鲳[6]、团头鲂[13]黑鱼(Channa argus)[38]中的实验结果相似, 说明适宜的Leu水平可以增强鳜幼鱼的免疫力和抗病能力。而亮氨酸水平过低可能导致鱼类生长受阻、代谢紊乱, 进而影响免疫系统的正常发育; 亮氨酸水平过高可能通过影响氨基酸平衡, 进而抑制与免疫相关的酶活性, 说明Leu水平过低或过高均不利于鱼体健康。
肿瘤坏死因子α (tnf-α)作为一种多效促炎细胞因子, 在参与炎症反应和细胞免疫应答等方面扮演着关键角色, 机体应激反应时tnf-α可诱导白细胞介素1β (il-1β)的产生和释放, il-1β进一步通过其受体激活信号通路, 以有效地驱动免疫反应[39]。Ren等[40]发现饲料中适宜水平的Leu对团头鲂肝脏中tnf-α的表达有抑制作用, 但高含量的Leu促进了tnf-α的表达, 说明适宜水平的饲料Leu缓解了肝脏炎症反应, 而过量摄食Leu促进肝脏炎症发生。转录因子nf-κb-p65在细胞核内调节多种基因的表达[41], 而下调NF-κB可降低人急性单核白血病细胞中tnf-α[42]、il-1β[43]的mRNA水平。pai也是参与免疫应答的重要因子, Kubala等[44]发现pai-1在胰腺导管腺癌中与免疫抑制标志物呈正相关, 其中pai-1能够促进M2巨噬细胞极化, 从而刺激免疫抑制。饮食中不平衡的支链氨基酸补充可导致核转录因子-κB (NF-κB)被激活, 进而诱发促炎细胞因子的过量产生, 从而导致炎症[45]。Jiang等[8]发现高Leu水平会下调草鱼肠道中tnf-α、白细胞介素8 (il-8)和nf-κb-p65的mRNA水平。来自鱼类的相关研究表明, 最佳水平的单链氨基酸(如Leu)补充对免疫状态有积极影响。例如, 通过在饲料中添加2.3%亮氨酸+0.7%缬氨酸对意大利罗非鱼(Oreochromis nilotica)肝脏炎症具有最佳抑制效果, 这可能是由于适当补充支链氨基酸水平而激活的SIRT1通过赖氨酸310的去乙酰化抑制NF-κB的活性, 下调NF-κB下游靶基因(如il-1β和il-6)的转录, 从而降低炎症反应[46, 47]。而在本研究中, 相较于L1.88组 和L4.9组, 肝脏中L3.13组il-1β、tnf-α、nf-κb-p65和pai的mRNA表达量显著下调。其中pai的下调可能是促炎症因子下调抑制了继发性炎症介质产生, 从而减少了肝脏急性期蛋白的产生, 造成pai的下调。以上结果与血清免疫指标的变化趋势一致, 这表明, 适宜的饲料Leu水平(3.13%—3.73%)可以通过提高免疫, 下调肝脏促炎性因子il-1β、tnf-α和nf-κb-p65的基因表达, 来降低减轻鳜幼鱼的炎症反应, 从而增强鱼体健康。Wang等[48]发现亮氨酸通过促进线粒体NAD+再生和增强线粒体功能, 激活NAD+依赖的去乙酰化酶SIRT1, 进而调节免疫细胞功能。在本研究中, Leu过量组炎症反应加剧可能是由于Leu过剩导致的这种代谢调节扰乱免疫细胞的正常功能, 最终影响免疫基因的表达。而Leu不足可能导致线粒体功能受损, 导致免疫细胞的代谢紊乱, 最终影响免疫基因的表达, 加重幼鱼的炎症反应。
4. 结论
适宜的Leu水平可以显著提高幼鱼阶段鳜的生长、抗氧化能力、肝脏健康和非特异性免疫能力。而饲料中Leu水平过高或过低均对鳜生长产生不利影响。以增重率为指标, 鳜幼鱼阶段Leu需要量为3.28%, 占蛋白质的6.92%。
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图 1 斑马鱼Notch1a和Notch1b结构示意图
NECD. 胞外结构域; TM. 跨膜域; NICD. 胞内段
Figure 1. Structure diagram of zebrafish Notch1a and Notch1b
NECD. Notch extracellular domain; TM. Transmembrane domain; NICD. Notch intracellular domain
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图 3 pCMV-N1aICD和pCMV-N1bICD真核表达载体的构建及验证
M1. DL5000 DNA Marker; 1. notch1a基因胞内段; 2. notch1b基因胞内段; M2. 蛋白分子量标准; 3. pCMV-Tag2B; 4. pCMV-N1aICD; 5. pCMV-N1bICD
Figure 3. Construction and validation of pCMV-N1aICD and pCMV-N1bICD eukaryotic expression vectors
M1. DL5000 DNA Marker; 1. N1aICD; 2. N1bICD; M2. protein marker; 3. pCMV-Tag2B; 4. pCMV-N1aICD; 5. pCMV-N1bICD
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图 4 N1aICD和N1bICD在HEK293T细胞中的定位
Figure 4. Localization of N1aICD and N1bICD in HEK293T cells
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图 5 斑马鱼hsp70启动子CpG岛和转录因子结合位点的预测
Figure 5. Prediction of CpG island and transcription factor binding sites in zebrafish hsp70 promote
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图 6 pGL3-hsp70-pro报告基因的构建及活性检测
M. DL5000 DNA Marker; 1. hsp70启动子的扩增; **表示与对照组有极显著性差异(P<0.01)
Figure 6. Construction and activity detection of pGL3-hsp70-pro reporter gene
M. DL5000 DNA Marker; 1. cloning of hsp70 promoter; ** means very significant difference compare with the control (P<0.01)
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图 7 验证N1aICD和N1bICD 对pGL3-hsp70-pro转录活性的影响
**表示与对照组有极显著性差异(P<0.01); 1. pCMV-Tag2B+pGL3-hsp70-pro; 2. pCMV-N1aICD+pGL3-hsp70-pro; 3. pCMV-N1bICD+ pGL3-hsp70-pro
Figure 7. Verification the effects of N1aICD and N1bICD on pGL3-hsp70-pro transcriptional activity
**means very significant difference compare with the control (P<0.01); 1. pCMV-Tag2B+pGL3-hsp70-pro; 2. pCMV-N1aICD+pGL3-hsp70-pro; 3. pCMV-N1bICD+pGL3-hsp70-pro
表 1 实验所用引物序列
Table 1 Primer sequence used in the experiment
引物名称
Primer name序列
Sequence (5′—3′)用途
Usagenotch1a-F1 GGCCTCCAGTGGAAACCT CDS 序列扩增
Amplification of CDS sequencesnotch1a-R1 CTACTTGAAGGCTTCTGGAATATG notch1b-F1 CAAAGGCTCCGTGGTTTAT notch1b-R1 AAGCAGGCTTATGGAATGTG notch1a-F2 CGCGGATCCTCCAGGAAGAGGAAGCGGG 表达载体构建
Construction of expression vectornotch1a-R2 CCCAAGCTTCTTGAAGGCTTCTGGAATATGGTTCATC notch1b-F2 CGCGGATCCTCCCGTAAACGGCGCCG notch1b-R2 CCCAAGCTTCTTGAATTGCTCGGGCATGTG hsp70-F CGAGCTCTTACGCGTGCTAGCTGAAGTGGACGGATTGAGTGA 报告基因载体构建
Construction of reporter gene vectorhsp70-R ACTTAGATCGCAGATCTCGAGAAACACCTCGTCGGGGAAAA 
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表 2 hsp70报告基因活性检测转染体系
Table 2 Transfection system for detecting hsp70 promoter reporter gene activity
组别
GrouppGL3-
Enhancer (ng)pGL3-hsp70-
pro (ng)pRL-
TK (ng)1 200 0 20 2 0 200 20
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表 3 转染复合物配制表
Table 3 Formulation table of transfected compound
组别
GrouppCMV-
Tag2B (ng)N1aICD
(ng)N1bICD
(ng)pGL3-hsp70-
pro (ng)pRL-TK
(ng)1 200 0 0 100 10 2 0 200 0 100 10 3 0 0 200 100 10
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表 4 斑马鱼Notch1a、Notch1b和人、小鼠Notch1氨基酸相似性分析(%)
Table 4 Amino acid similarity analysis of zebrafish Notch1a, Notch1b, human and mouse Notch1 (%)
物种
Species斑马鱼
Danio rerio人
Homo sapiens小鼠
Mus musculusNotch1a Notch1b Notch1 Notch1 斑马鱼
Danio
rerioNotch1a 100.00 68.72 66.86 64.41 Notch1b 68.72 100.00 67.67 67.72
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