DEVELOPMENT AND APPLICATION OF REAL-TIME AND LATERAL FLOW DIPSTICK RECOMBINASE POLYMERASE AMPLIFICATION ASSAYS FOR RAPID SPECIES IDENTIFICATION OF PELTEOBAGRUS FULVIDRACO
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摘要:
研究以黄颡鱼为目标对象, 基于重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification, RPA)等温扩增技术, 开发了实时荧光型RPA和侧向流RPA试纸条两种现场快速检测方法。这些方法能够用于快速、准确和灵敏地实时检测出黄颡鱼DNA。首先, 通过对黄颡鱼及其近缘物种的鱼类线粒体基因组序列进行对比分析, 针对COI基因保守区域, 设计了特异性探针和引物。测试结果显示, 在37℃条件下, 实时荧光型RPA和侧向流RPA试纸条都具有良好的特异性。实时荧光型RPA方法能够在20min内完成黄颡鱼DNA的检测, 且最低检测限可以达到102拷贝数/反应; 而侧向流RPA试纸条的操作更加便捷, 能够在10min内可完成对102低拷贝数的黄颡鱼DNA的扩增和鉴定。应用这两种RPA检测技术对149份长江流域常见鱼类进行现场检测, 两种方法均显示出较高的准确性(准确率100%)。因此, 研究开发的两种用于检测黄颡鱼的实时荧光型RPA和侧向流RPA试纸条方法, 拥有操作简便、结果直观、准确率高、不依赖实验室仪器设备等优势, 具有良好的现场快速检测应用前景。此外, 其克服了形态学物种鉴定专业门槛高、难以鉴定残破组织样品的问题, 检测靶标可跨越卵、鱼苗、成鱼等全生命周期, 为水产品监管执法提供技术手段。
Abstract:In order to effectively prevent illegal fishing of wild fishery resources in the Yangtze River, it is crucial to provide technical support for the “ten-year ban on fishing in the Yangtze River” and develop methods that can quickly and accurately identify fish species on site. This study focuses on Pelteobagrus fulvidraco and utilizes isothermal amplification technology, specifically Recombinase Polymerase Amplification (RPA), to develop two rapid on-site detection methods: Real-time fluorescent RPA and lateral flow RPA test strips, which are ideally suited for the swift in-field detection of P. fulvidraco DNA. We developed an RPA assay based on either Real-time fluorescent detection (Real-time RPA assay) or lateral flow dipstick (RPA-LFD assay) for rapid, accurate, and sensitive detection of P. fulvidraco DNA, facilitating effective management of the fishing ban in the Yangtze River basin. Primers and probes for both assays were designed to target conserved regions of the mitochondrial cytochrome c oxidase subunit Ⅰ (COⅠ) gene in P. fulvidraco. Tests demonstrated that both the Real-time RPA and RPA-LFD assays exhibited good specificity at 37℃. The Real-time RPA assay achieved a detection limit of 102 copies of P. fulvidraco DNA per reaction, with amplification completed within 20min, though it requires a constant temperature amplification instrument. In contrast, the RPA-LFD assay offers a more convenient operation with a shorter amplification time of only 10min for 102 copies of P. fulvidraco DNA. Additionally, both methods were tested on 149 samples for known fish species, yielding results consistent with actual species identification. The Real-time fluorescence RPA and lateral flow dipstick RPA methods developed in this study for detecting P. fulvidraco DNA have the advantages of easy operation, intuitive results, high accuracy, and no dependence on laboratory instruments and equipment. They have good prospects for rapid on-site detection applications. In addition, it overcomes the problems of high professional threshold for morphological species identification and difficulty in identifying damaged tissue samples. The detection targets can span the entire life cycle of eggs, fish fry, and adult fish, providing essential technical support for aquatic product supervision and law enforcement.
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黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)是一种有重要价值的小型经济鱼类, 广泛分布于我国淡水水体中, 在长江中下游的分布更为集中[1—3]。黄颡鱼在分类学上隶属于鲇形目, 鲿科, 疯鲿属, 具有体长、头大且平扁、无鳞、背鳍和胸鳍均具发达的硬刺等特征, 其肉质鲜嫩、口感极佳, 深受消费者的青睐[4, 5]。近年来, 随着水环境污染的加剧和滥捕滥捞的日益严重, 黄颡鱼栖息环境遭受了前所未有的破坏, 其野生种质资源数量也急剧减少[6—8]。为保护包括黄颡鱼在内的长江野生种质资源, 国家实施了“长江禁捕、十年禁渔”重大战略, 开发出能够现场快速准确地鉴定长江鱼类物种的技术方法显得至关重要。
目前鱼类现场鉴定多采用形态学的方法, 即通过观察、测量和记录鱼类的外形特征, 如全长、体长、背鳍的数量、有无腹棱、有无刺等[9, 10]。该方法简便、直观, 但其性状易受到环境影响在遗传表达时不太稳定, 当面临不完整的形态结构特征或相似的鱼类物种时, 可能会遇到重重困难, 甚至无法准确鉴定[11]。黄颡鱼属共有普通黄颡鱼(P. fulvidraco) 、长须黄颡鱼(P. eupogon) 、瓦氏黄颡鱼(P. vachelli) 、光泽黄颡鱼(Pelteobagrus nitidus) 和中间黄颡鱼(P. intermedius) 5 种, 前4 种在长江水系广泛分布。目前对黄颡鱼的分类尚存在一些争议, 主要是所依据的形态学标准存在一定差异[12—14]。此外, 在处理水产制品及加工水产品时, 形态学方法已不再适用, 只有通过DNA技术才能确定物种。
近年来, 分子技术在鱼类物种鉴定中被广泛应用。该技术具有操作简单、稳定性高和鉴定准确等优点。分子技术常用的分子标记包括DNA条形码、简单重复序列(SSR)、随机扩增多态性DNA(RAPD), 单核苷酸多态性(SNP)等[15—17]。作为分子技术的代表, 近期PCR技术得到了显著的改进, 发展出实时荧光定量PCR、数字PCR和微流控芯片等新型核酸检测技术[18—20]。这些新技术虽然提高了检测的准确率, 但对人员、设备、实验环境等软硬件要求较高, 且检测时限较长, 无法满足现场实时快速检测及监管执法的时效性需求。
RPA技术是一种新型的依赖多种酶与蛋白参与的恒温核酸扩增技术, 由Piepenburg等[21] 、CATTAMANCHI等[22]在2006年首次提出, 该技术以其快速、便捷的特点, 在核酸检测分析领域具有广泛的应用价值。作为一项PCR替代检测技术, RPA近几年在水生动物疫病检测领域开始应用。如王慧芳等[23]成功研发出一种针对大西洋鳕的RPA-LFD检测方法。陈雨等[24]成功建立荧光RT-RPA检测方法, 可快速、特异性地检测出病毒性败血性病毒。蒋玉涵[25]成功构建针对锦鲤疱疹病毒(KHV)、鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)和草鱼呼肠孤病毒(GCRV)三种病原的RPA荧光检测法。然而, RPA技术尚未广泛应用于水生生物物种鉴定。
为及时、准确地提供物种鉴定报告, 加强对长江流域野生黄颡鱼非法捕捞的监管执法, 本研究以黄颡鱼COI基因为靶标, 建立了实时荧光型RPA和侧向流RPA试纸条的检测方法。上述技术具有操作简便、灵敏度高、快速准确等优点, 用于鉴定黄颡鱼物种, 可准确区分甄别黄颡鱼与瓦氏黄颡鱼、长须黄颡鱼等物种, 可对市面上售卖的黄颡鱼进行准确快速鉴别, 从而为长江禁捕监管工作提供有力支持。
1. 材料与方法
1.1 供试样本
来源于长江野生捕捞鱼样本149份(由中国水产科学院淡水渔业研究中心于2023年3月至2023年9月间, 在长江下游江段获取, 包括江西、安徽、江苏、浙江、上海江段), 本次捕捞活动已获得农业农村部门颁发的渔业捕捞许可证。全鱼碎冰保存运回中国水产科学院淡水渔业研究中心实验室, 运用传统形态学将其分门别类, 数目物种如下: 黄颡鱼14份、长须黄颡鱼6份、瓦氏黄颡鱼6份、光泽黄颡鱼6份、鲢20份、鳙14份、青鱼6份、草鱼12份、刀鲚7份、短额鲚6份、鳜14份、大眼鳜6份、翘嘴鲌14份、达氏鲌6份、蒙古鲌6份、红鳍原鲌6份。而后, 淡水渔业中心将149份样本取肌肉组织提取DNA, 最后寄送三亚中国检科院生物安全中心。
阳性质粒: 根据NC_018768.1、MH192350.1、KT202282.1、HM746659.1黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼、长须黄颡鱼和光泽黄颡鱼COI基因, 分别人工合成并插入pMV载体中构建质粒并保存。
1.2 试剂和仪器
荧光型DNA恒温快速扩增试剂盒、基础型DNA恒温快速扩增试剂盒、胶体金试纸条型DNA恒温快速扩增试剂盒和恒温快速扩增仪(型号: WL-16-Ⅱ)(均购自安普未来生物科技有限公司)、动物组织基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)、Nano Drop Eight超微量紫外分光光度计(赛默飞世尔科技公司)、移液器(德国Eppendorf 公司)。
1.3 引物探针的设计
在NCBI的NR数据库中, 比对搜索黄颡鱼及其近缘物种的COI序列。将这些同源序列经过ClustalX比对处理后, 筛选出黄颡鱼COI序列的特异性识别位点区域。依据这些位点, 设计了RPA引物、exo荧光探针和nfo探针(表 1), 仅能用于黄颡鱼COI特异性扩增。由北京六合华大基因科技有限公司提供本研究设计的所有引物和探针。
表 1 RPA引物探针设计与序列Table 1. Primers and probes sequences名称Name 基因序列Sequence (5′—3′) P. fulvidraco-Fe TCGTCGTGGCATGCCAGCTAAGCCTAGGAAGTG P. fulvidraco-Re CGTATTTGCCATCATAGGAGCCTTCGTACACTG P. fulvidraco-Pe CCAAAGTGGATTTTTGTTCAGGTGTCATGTA/i6FAMdT/T/idSp//iBHQ1dT/ATAGCCCGTAAATAG/iSpC3/ P. fulvidraco-Rn 5′Biotin-CTTCCACTACGTCTTATCAATGGGGGCCGTAT P. fulvidraco-Pn 5′FAM-TGTATAGCCCGTAAATAGGGGGAATCAGTGT[THF]ACGAAGGCTCCTATG-3′C3 Spacer 1.4 荧光RPA反应体系的建立
用荧光型DNA恒温快速扩增试剂盒, 制备50 µL RPA反应体系: 上下游引物(10 μmol/L) 2 μL、探针(10 μmol/L) 0.6 μL、A buffer (水化缓冲液)29.4 μL和ddH2O 11.5 μL管预混; 再加入到冻干粉中, 与冻干粉中的重组酶、核酸外切酶、单链结合蛋白及聚合酶充分混匀, 随后加入模板, 最后加入含有280 mmol/L醋酸镁的2.5 μL B buffer, 经快速涡旋振荡后12000 r/min瞬离, 放入型号为WL-16-Ⅱ的恒温荧光检测仪中进行检测。荧光检测程序设置: 反应温度37—41℃, 反应时间20min, 以30s为单位收集FAM通道的荧光信号。通过对其反应系统的优化, 构建基于荧光RPA的检测方法。
1.5 荧光RPA方法的灵敏度检测
通过10倍梯度稀释pMV-HSY-COI黄颡鱼的重组质粒至102—105 copies/反应, 并用荧光RPA进行实时荧光检测, 确定其最低检测下限。
1.6 荧光RPA方法的特异性检测
根据实时荧光RPA扩增反应体系及试验步骤, 对所提取的黄颡鱼DNA与相近鱼种的DNA进行检测特异性的鉴定, 以pMV-HSY-COI黄颡鱼重组质粒作为阳性检测对象。
1.7 荧光RPA方法的重复性检测
采用pMV-HSY-COI黄颡鱼重组质粒105和103 copies/反应, 进行实时荧光RPA重复性试验, 分别对这2种浓度进行6次重复测定, 并对其可重复性进行分析。
1.8 侧向流RPA试纸条的方法建立
侧向流RPA试纸条的扩增体系: 2 μL 上下游引物(10 μmol/L)、 0.6 μL 探针(10 μmol/L)、29.4 μL A buffer和 11.5 μL ddH2O预混后加入冻干粉中, 与其中含有的核酸外切酶、聚合酶、重组酶及单链结合蛋白充分混匀, 然后再加入2 μL模板, 最后加入含有280 mmol/L醋酸镁2.5 μL B buffer, 经快速涡旋振荡后12000 r/min瞬离, 立即将其置于37℃恒温10min; 反应完成后, 向含190 µL ddH2O的离心管中添加10 μL扩增产物, 振荡混匀后, 将50 µL的混合物垂直向下添加至试纸条的样品垫上, 在室温下放置10min让扩增产物与试纸条上的抗体或捕获分子充分反应, 反应结束后观察试纸条上的质控线和检测线。质控线通常用于指示试纸条是否工作正常, 而检测线则用于指示是否存在目标物质。
1.9 侧向流RPA试纸条的特异性试验
利用建立的侧向流RPA试纸条扩增体系及反应程序, 以提取黄颡鱼DNA作为阳性对照样品, 其他的近缘物种鱼类DNA进行特异性验证。
2. 结果
2.1 引物探针筛选结果
通过对NCBI的NR数据库进行同源比对搜索, 收集黄颡鱼及其近缘物种的COI基因序列。利用ClustalX软件将这些序列进行同源比对, 并在此基础上筛选出黄颡鱼种内保守、种间特异区域; 针对该区域, 设计筛选出特异性最好的用于检测黄颡鱼DNA的实时荧光RPA和试纸条型RPA引物探针(表 1)。
2.2 荧光RPA方法的建立
如图 1所示, 本研究所建立的方法首先是使用动物组织基因组DNA提取试剂盒进行核酸提取, 其次是配制RPA反应体系, 漩涡混匀并短暂离心后, 即可上机进行RPA恒温扩增, 最后扩增的产物可以在荧光RPA仪上收集荧光信号形成扩增曲线, 通过有无扩增曲线判定该样本是否含有黄颡鱼的DNA, 另外也可以在侧向流RPA试纸条上观察阳性条带的有无和深浅, 可以直观地判断样品中是否包含黄颡鱼的DNA。
为了确定实时荧光型RPA的理想扩增温度, 本研究设置了3个反应温度条件: 37℃、39℃和41℃。实时荧光型RPA的扩增体系: 上下游引物(10 μmol/L) 2 μL、探针(10 μmol/L)0.6 μL、29.4 µL A buffer, 2.5 µL含有MgAc的B buffer, 2 µL pMV-HSY-COI重组质粒模板, 补ddH2O至50 µL; 加入冻干粉中(含有核酸外切酶、聚合酶、重组酶和单链结合蛋白), 经快速涡旋振荡后12000 r/min瞬离; 然后将实验组放置在实时荧光定量PCR仪中进行扩增并采集荧光信号。本研究采用了以下判定规则: 当在FAM荧光通道上观察到明显的扩增曲线时, 这表示目标DNA序列在反应过程中被成功扩增, 因此可以判定该样本属于黄颡鱼物种; 当在FAM荧光通道上没有观察到任何扩增曲线, 判定该样本并非黄颡鱼物种。
黄颡鱼荧光RPA检测的整个时长约为20min。结果显示, 当反应温度为37℃时, 呈现出较好的扩增曲线和扩增效率(图 2A), 并且在扩增浓度为105拷贝数时, 反应20个循环, 便已经达到了扩增的平台期, 产生了理想的扩增曲线; 而在39℃和41℃的条件下, 即便反应进行了40个循环, 仍然无法获得理想的扩增曲线。因此, 当反应条件为最佳温度37℃时, 荧光RPA能够在20min内较好地完成黄颡鱼的物种鉴定。
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图 2 不同温度条件下的实时荧光型RPA反应A. 37℃; B. 39℃; C. 41℃Figure 2. Optimization of Real-time fluorescent RPA reaction under different temperatures2.3 侧向流RPA试纸条的反应条件优化
荧光RPA方法虽然灵敏, 但是依赖于恒温快速扩增仪, 不适用于野外采样鉴定。为了实现水产品现场快检的目的, 本研究在荧光RPA的基础上做了进一步的开发。将制备好的黄颡鱼特异性的引物和探针溶液固定在结合垫上, 并与预处理的硝酸纤维膜及其他组件组装, 开发出了便携的侧向流RPA快速检测试纸条产品。通过观察试纸条上的阳性条带的有无和深浅, 可以直观地判断样品中是否包含黄颡鱼的DNA, 无需专业设备进行结果分析。首先, 本研究设置3个反应温度(37、39和41℃), 对该侧向流RPA试纸条进行最佳反应温度测试。结果显示, 在37、39和41℃时, 黄颡鱼RPA-LFD试纸条的检测线都呈现出清晰可见的阳性条带, 表明这3个温度能够有效地检测出黄颡鱼, 而较高的孵育温度对阳性条带的颜色深度没有显著影响(图 3)。因此, 37℃可以作为该试纸条的最佳反应温度。另外, 本研究在37℃条件下, 测试5种孵育时间(5min、8min、10min和12min)的影响。结果显示, 孵育5min时即可检测出较弱的阳性条带, 而在孵育8min、10min和12min显现出较为清晰的阳性条带。因此, 37℃孵育8—10min可以作为该试纸条的推荐反应条件, 用于黄颡鱼的鉴定。
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图 3 侧向流RPA试纸条的反应条件优化A. 侧向流RPA试纸条在不同的温度条件下的实验结果; B. 侧向流RPA试纸条在不同反应时间的实验结果Figure 3. Optimization of RPA-LFD assay2.4 灵敏度试验
为了确定黄颡鱼实时荧光型RPA和RPA-LFD方法的灵敏度, 本研究使用pMV-HSY-COI重组质粒, 并将其进行梯度稀释(10—105 拷贝数/反应)用来评估测定。结果显示, 荧光型RPA能够达到102拷贝数/反应的最低检测限(图 4A); 与此同时, 使用RPA-LFD方法进行检测时, 在 >103拷贝数/反应组中, 均能呈现出明显的阳性条带。即便在低拷贝数组中(102拷贝数/反应), 也能够检测出相对较弱但仍可辨别的阳性信号(图 4B)。因此, 该实验说明荧光型RPA和RPA-LFD方法都具有足够灵敏度, 能够用于低含量的DNA拷贝数的检测, 适用于黄颡鱼物种的微量鉴定。
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图 4 实时荧光型RPA和侧向流RPA试纸条灵敏度试验结果A. 实时荧光型RPA检测黄颡鱼DNA灵敏度; B. 侧向流RPA试纸条检测黄颡鱼DNA灵敏度结果; NC代表阴性对照Figure 4. Sensitivity results of Real-time fluorescent RPA and RPA-LFD assay2.5 荧光RPA方法重复性检测
将pMV-HSY-COI重组质粒稀释不同浓度作为模板, 利用本文优化后的实时荧光RPA, 对其进行了重复性检测, 发现各组内变异系数均小于2%。试验结果表明该荧光RPA的重复性良好。
2.6 特异性试验
本研究使用黄颡鱼及其一些常见的长江鱼类, 对这两种方法进行了特异性的试验。为避免物种的遗传多样性带来的检测偏差, 本研究采集来源于长江养殖的15种鱼样本共计149尾(每种鱼至少包含6尾), 分别提取DNA, 并将相同物种的DNA进行等量混合, 用于现场检测。结果发现仅以黄颡鱼DNA为模板的组可以产生特异性的荧光扩增曲线, 而其余的组均未见明显的荧光扩增曲线(图 5), 表明黄颡鱼实时荧光型RPA方法能够有效地区别黄颡鱼和非目标物种, 从而在长江流域实现物种特异性的鉴定。与此同时, RPA-LFD方法也获得了相同的结果: 只在黄颡鱼中检测出阳性条带(图 6), 均没有与中国长江流域其他14种常见物种产生交叉反应, 其准确率达到100%, 表明RPA-LFD也具有良好的物种特异性。
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图 6 侧向流RPA试纸条特异性试验结果1. 黄颡鱼; 2. 长须黄颡鱼; 3. 瓦氏黄颡鱼; 4. 光泽黄颡鱼; 5. 鲢; 6. 鳙; 7. 青鱼; 8. 草鱼; 9. 刀鲚; 10. 短额鲚; 11. 鳜; 12. 大眼鳜; 13. 翘嘴鲌; 14. 达氏鲌; 15. 蒙古鲌; 16. 红鳍原鲌; 17. 阴性对照Figure 6. Specificity results of RPA-LFD assay表 2 实时荧光型RPA和侧向流RPA试纸条对鱼类样本的检测结果Table 2. Detection results of fish samples by Real-time fluorescent RPA and RPA-LFD assay鱼类样本Fish sample 样品数Sample quantity 荧光RPA检测结果Results of Real-time fluorescent RPA 侧向流RPA试纸条检测结果Results of RPA-LFD assay 黄颡鱼Pelteobagrus fulvidraco 14 ＋ ＋ 长须黄颡鱼Pelteobagrus eupogon 6 － － 瓦氏黄颡鱼Pelteobagrus vachellii 6 － － 光泽黄颡鱼Pelteobaggrus nitidus 6 － － 鲢Hypophthalmichthys molitrix 20 － － 鳙Hypophthalmichthys Nobilis 14 － － 青鱼Mylopharyngodon piceus 6 － － 草鱼Ctenopharyngodon idella 12 － － 刀鲚Coilia nasus 7 － － 短额鲚Coilia brachygnathus 6 － － 鳜Siniperca chuatsi 14 － － 大眼鳜Siniperca knerii 6 － － 翘嘴鲌Culter alburnus 14 － － 达氏鲌Chanodichthys dabryi 6 － － 蒙古鲌Chanodichthys mongolicus 6 － － 红鳍原鲌Culter erythropterus 6 － － 注: “＋”代表检测结果阳性, “－”代表检测结果阴性 Note: “＋” represent the positive results, “－” represent the negative results. 3. 讨论
为打击市场销售长江流域非法捕捞渔获物, 对渔获物的物种检测鉴定必不可少。目前常用的采样后送实验室检测, 流程长、耗时多, 不能满足水产品监管执法的时效性要求。近期, 新型现场快速检测技术不断发展, 其具有快速、操作简便、经济等特点, 对仪器设备依赖程度低, 并日趋智能化、直观化、信息化, 可以解决上述监管难题, 成为检验检测发展的趋势[26, 27]。
传统的鱼类物种鉴定方法主要依赖于形态学特征, 而生物形态是物种多种形状的集合, 受遗传基因及环境的共同影响。然而, 黄颡鱼本身依据形态学分类存在一定争议, 主要原因是形态学分类标准有一定差异, 仅靠前颌骨齿带长宽比或背鳍前部形态等单一特征有时并不十分精确[13, 14, 28, 29]。为了解决此问题, 毛惠玲等[30]应用多变量形态度量学结合传统形态学特征方法, 分析黄颡鱼的13 个可量性状和15 个框架结构数据, 建立了4种黄颡鱼的准确形态学种群判别法。然而, 该形态学鉴定技术需要精准测量采集黄颡鱼的形态学数据, 还要掌握聚类、主成分等分析技术, 具备相当的技术门槛, 时效性也不强。而分子生物学技术的发展, 为黄颡鱼的物种分类及遗传结构分析提供了新的技术工具。库喜英等[31]通过对黄颡鱼线粒体Cytb基因序列的分析, 证实P. sinensis与P. fulvidraco为同种黄颡鱼的2个形态种群, P. sinensis不是有效种, 推翻了形态学的研究结论。上述研究, 进一步揭示了有限的形态学特征作为物种分类依据的局限性, 结合分子遗传学和形态学特征的综合研究, 为水生鱼类精准物种分类提供了可能。
目前, DNA分子标记、RAPD技术、DNA条形码等技术已应用于黄颡鱼物种准确鉴定及遗传分析。譬如巩高瑞等[32]利用DNA分子标记对黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种的分析, 发现通过物种间的遗传差异可以筛选出一种能将其准确鉴定出来的分子遗传标记方法; 赵文学等[33]通过RAPD技术对4种黄颡鱼进行鉴定, 筛选出了6条能区分不同品种黄颡鱼的引物; 赵新宁[34]利用DNA条形码技术对青岛市售的74份商品三文鱼进行种类鉴定, 可准确鉴定出大麻哈鱼、虹鳟、大西洋、银大麻哈鱼4个物种。然而, 以普通PCR为基础的 DNA条形码技术、RAPD技术及DNA分子标记等方法, 虽准确度高, 但操作复杂、耗时长且依赖实验室扩增仪和测序技术, 同时存在成本高等局限性。因此, 新型现场快速分子检测技术的发展与应用势在必行。
作为PCR替代技术, RPA、环介导等温扩增(Loop-mediated isolated amplification, LAMP)、CRISPR/Cas12等方法能在恒温条件下进行, 无需热循环, 能够在20min或40min内快速得出结果, 大大缩短了反应时间[35]; 可通过特异性引物扩增目标DNA片段, 具有较高的准确性[36]; 而且操作简便, 无需复杂的实验室设备和操作技能, 降低了技术门槛, 使其更适合在现场应用; 同时适用于各种样本类型, 大大降低物种鉴定和执法技术难度。相比LAMP及CRISPR技术, RPA技术的优点在于: RPA仅使用2条引物、1个标记探针, 反应体系配制简单, 且国内从反应酶到配套设备均已国产化, 成本较低 [37, 38]。
因此, 本研究基于实时荧光型RPA和侧向流RPA试纸条, 成功研发了黄颡鱼DNA物种快速鉴定技术。基于黄颡鱼COI基因序列保守区, 设计针对黄颡鱼RPA特异性引物和探针, 通过条件摸索选用优化后的RPA反应条件和扩增体系, 提高检测的特异性和敏感性, 成功建立快速实时荧光RPA和侧流层析试纸条型RPA检测方法, 分别能在20min和10min内完成扩增, 对黄颡鱼DNA的检测低限可以达到102copies/反应。另外, 采用这两种方法分别进行了重复性和特异性试验, 重复性试验结果偏差小说明具有良好的可重复性; 特异性试验结果表明反应体系对光泽黄颡鱼等相近物种DNA无交叉反应, 说明反应体系具备良好的特异性; 此外对已知149份鱼类物种样本进行检测, 试验结果与实际情况符合, 符合率100%。本研究结果进一步证明了本研究所建立的黄颡鱼RPA快速物种鉴定方法具有高效性和准确性。
RPA技术由Piepenburg等[21]于2006年研发, 常被应用于动物[39, 40]和植物[41]等领域各种疾病的快速检测, 尤其是包括新冠病毒在内的医学POCT快速检测鉴定。其检测灵敏度甚至可达到500 copies/mL, 这个检测灵敏度相比本研究黄颡鱼检测灵敏度提高了4倍, 证明本技术方法尚有优化空间[42]。虽然本研究目标是黄颡鱼物种鉴定, 相比病原痕量核酸检测需求, 对检测灵敏度要求不高, 现有荧光RPA和RPA-LFD技术完全可满足需求。但下一步, 仍可考虑通过优化引物、修改靶点等方式进一步提升黄颡鱼RPA检测技术的灵敏度, 以应对可能出现的微量组织物种追溯需求。
综上所述, 本文以黄颡鱼为研究对象, 采用实时荧光 RPA和 RPA-LFD技术实现快速、准确和灵敏地实时检测黄颡鱼DNA, 并对中国长江地区其他重要鱼类也进行了检测, 结果表明无交叉反应。该研究成果将为基层工作人员提供方便、准确的初步诊断工具, 可在相对恶劣的野外环境中实现快速、准确、灵敏的检测; 为国家市场监管、公安、渔业执法提供强有力的技术支撑, 也为“长江十年禁渔”战略提供执法技术手段。
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图 2 不同温度条件下的实时荧光型RPA反应
A. 37℃; B. 39℃; C. 41℃
Figure 2. Optimization of Real-time fluorescent RPA reaction under different temperatures
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图 3 侧向流RPA试纸条的反应条件优化
A. 侧向流RPA试纸条在不同的温度条件下的实验结果; B. 侧向流RPA试纸条在不同反应时间的实验结果
Figure 3. Optimization of RPA-LFD assay
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图 4 实时荧光型RPA和侧向流RPA试纸条灵敏度试验结果
A. 实时荧光型RPA检测黄颡鱼DNA灵敏度; B. 侧向流RPA试纸条检测黄颡鱼DNA灵敏度结果; NC代表阴性对照
Figure 4. Sensitivity results of Real-time fluorescent RPA and RPA-LFD assay
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图 6 侧向流RPA试纸条特异性试验结果
1. 黄颡鱼; 2. 长须黄颡鱼; 3. 瓦氏黄颡鱼; 4. 光泽黄颡鱼; 5. 鲢; 6. 鳙; 7. 青鱼; 8. 草鱼; 9. 刀鲚; 10. 短额鲚; 11. 鳜; 12. 大眼鳜; 13. 翘嘴鲌; 14. 达氏鲌; 15. 蒙古鲌; 16. 红鳍原鲌; 17. 阴性对照
Figure 6. Specificity results of RPA-LFD assay
表 1 RPA引物探针设计与序列
Table 1 Primers and probes sequences
名称Name 基因序列Sequence (5′—3′) P. fulvidraco-Fe TCGTCGTGGCATGCCAGCTAAGCCTAGGAAGTG P. fulvidraco-Re CGTATTTGCCATCATAGGAGCCTTCGTACACTG P. fulvidraco-Pe CCAAAGTGGATTTTTGTTCAGGTGTCATGTA/i6FAMdT/T/idSp//iBHQ1dT/ATAGCCCGTAAATAG/iSpC3/ P. fulvidraco-Rn 5′Biotin-CTTCCACTACGTCTTATCAATGGGGGCCGTAT P. fulvidraco-Pn 5′FAM-TGTATAGCCCGTAAATAGGGGGAATCAGTGT[THF]ACGAAGGCTCCTATG-3′C3 Spacer 
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表 2 实时荧光型RPA和侧向流RPA试纸条对鱼类样本的检测结果
Table 2 Detection results of fish samples by Real-time fluorescent RPA and RPA-LFD assay
鱼类样本Fish sample 样品数Sample quantity 荧光RPA检测结果Results of Real-time fluorescent RPA 侧向流RPA试纸条检测结果Results of RPA-LFD assay 黄颡鱼Pelteobagrus fulvidraco 14 ＋ ＋ 长须黄颡鱼Pelteobagrus eupogon 6 － － 瓦氏黄颡鱼Pelteobagrus vachellii 6 － － 光泽黄颡鱼Pelteobaggrus nitidus 6 － － 鲢Hypophthalmichthys molitrix 20 － － 鳙Hypophthalmichthys Nobilis 14 － － 青鱼Mylopharyngodon piceus 6 － － 草鱼Ctenopharyngodon idella 12 － － 刀鲚Coilia nasus 7 － － 短额鲚Coilia brachygnathus 6 － － 鳜Siniperca chuatsi 14 － － 大眼鳜Siniperca knerii 6 － － 翘嘴鲌Culter alburnus 14 － － 达氏鲌Chanodichthys dabryi 6 － － 蒙古鲌Chanodichthys mongolicus 6 － － 红鳍原鲌Culter erythropterus 6 － － 注: “＋”代表检测结果阳性, “－”代表检测结果阴性 Note: “＋” represent the positive results, “－” represent the negative results.
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