NEGATIVE REGULATORY EFFECT OF SCVL ON BIOFILM FORMATION OF VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS
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摘要:
为探讨scvL在副溶血弧菌生物膜形成中发挥的具体作用, 本研究以导致凡纳滨对虾急性肝胰腺坏死症的副溶血弧菌菌株SHY1833为对象, 通过基因敲除和回补技术构建了scvL的缺失突变株ΔscvL, 回补株ΔscvL: pscvL和过表达株WT: pscvL, 同时构建胞外多糖基因簇基因cpsA的缺失突变株ΔcpsA作为对照。利用结晶紫染色和SYTO-9荧光测定生物膜形成量显示, 缺失scvL后明显促进了SHY1833 生物膜形成量, 相反, 过表达scvL抑制了生物膜形成; 与预期结果一致cpsA缺失导致生物膜形成量下降; 这说明scvL对副溶血弧菌生物膜形成发挥负调控作用。菌落形态观察表明 scvL缺失还导致SHY1833菌落呈皱褶且不透明表型。利用qPCR分析显示scvL缺失造成了胞外多糖合成基因簇基因的转录上调, 进一步, 采用苯酚硫酸法测定胞外多糖揭示其胞外分泌的不可溶性多糖的明显增多。研究结果为揭示scv基因簇在副溶血弧菌生物膜形成中的作用机制提供了基础。
Abstract:Vibrio parahaemolyticus is considered to be one of the threatening pathogens for marine animals, which caused huge annual economic losses to the aquaculture. Biofilm formation, a bacterial defense strategy against environmental threats, contribute to the colonization and survival of V. parahaemolyticus during infection of host. Recent study reported that a gene cluster called scv (syp-like locus in V. parahaemolyticus) was found to be involved into V. parahaemolyticus biofilm production, however, the role of most genes in scv gene cluster, including scvL remains to be elucidated. In this study, V. parahaemolyticus strain SHY1833 was isolated from diseased Pacific white leg shrimp (Litopenaeus vannamei) that exhibited acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND). In order to explore the function of scvL in biofilm formation, the in-frame deletion mutant (ΔscvL) was constructed using the allelic exchange method. Additionally, a complemented strain (ΔscvL: pscvL) and an over-expressed strain (WT: pscvL) were generated by introducing pBBR-scvL into the ΔscvL mutant and the wild-type SHY1833 (WT), respectively. Meanwhile, the cpsA deleted mutant (ΔcpsA) was also made as a control for affecting biofilm formation. Crystal violet staining and SYTO-9 fluorescence assays showed that the scvL deletion significantly increased biofilm formation, while scvL overexpression decreased it. As expected, cpsA deletion resulted in decreased biofilm formation. Therefore, it can be concluded that scvL negatively affected the biofilm formation in strain SHY1833 of V. parahaemolyticus. Additionally, the colony morphology was also examined on Congo red plate, revealing that the colonies of ΔscvL were more opaque and rugose compared with that of WT strain. qPCR analysis showed that the transcriptional level of a number of cps genes was considerably elevated in the scvL deletion strain and downregulated in the scvL-overexpressed strain when compared to the WT strain. Consistently, phenol-sulfuric acid methods for determination of expolysaccharide showed that the deletion of scvL caused the significant increase in extracellular insoluble polysaccharides. In summary, these results offer a basis for clarifying how the scv gene cluster contributes to V. parahaemolyticus biofilm development.
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Keywords:
- scvL /
- Biofilm /
- Regulation /
- Extracellular polysaccharides /
- Vibrio parahaemolyticus
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金沙江为长江上游河段, 发源于青海省境内唐古拉山北麓的各拉丹东雪山(海拔6621 m)和尕恰迪如岗雪山(海拔6513 m)之间, 位于青藏高原、云贵高原、四川盆地西部边缘, 源头至当曲河口称沱沱河, 自河源流经青海、西藏、四川、云南, 至宜宾与岷江汇合后称长江[1]。河源至宜宾河道全长3486.1 km, 落差5142.5 m, 河道平均坡降1.48‰, 流域面积47.32×104 km2, 全流域平均高程3720 m。金沙江习惯上分为三段: 当曲河口至石鼓为上游河段, 石鼓-雅砻江汇口为中游河段, 攀枝花市-宜宾岷江汇口为下游河段。金沙江中游河段全长763.5 km, 落差1023.9 m, 是长江上游鱼类资源最为丰富的区域之一[2], 同时也是我国重要的水电基地[3], 规划龙盘-两家人-梨园-阿海-金安桥-龙开口-鲁地拉-观音岩-金沙-银江10个梯级水电站, 目前已建成观音岩、金安桥、阿海、鲁地拉、龙开口、梨园、金沙7个梯级电站, 在建银江1个梯级电站。随着梯级电站的完工和投入使用, 金沙江中游原本的自然河段变成片段化的缓流甚至静水的水库生境, 极大影响流域内原有的鱼类群落结构和分布状况。
在金沙江中游水电开发持续推进的背景下, 掌握规划河段鱼类资源现状, 分析鱼类多样性和群落差异, 是制定金沙江中游鱼类多样性保护措施, 优化鱼类栖息地空间布局的前提和依据。目前金沙江中游鱼类资源的资料较为丰富, 但存在时间久远等问题。吴江等[4]于1983—1984年系统调查了整个金沙江的鱼类资源状况, 共计采集到161种鱼类, 隶属于7目19科89属, 并对金沙江鱼类区系进行了系统划分, 认为石鼓附近的虎跳峡是长江鱼类中古北区与东洋区物种的分界点。2007—2008年, 顾洪宾等[5]系统性地整理和报道了金沙江中游的鱼类组成, 干支流累计采集到62种鱼类, 结果显示鱼类主要以裂腹鱼类为主, 高原鳅类为其次, 鱼类资源总体较为丰富。《金沙江流域鱼类》[1]于2008—2017年进行了11次采样, 采样点覆盖金沙江干流及各主要支流, 共记述金沙江流域所产鱼类200种(包括3新种), 其中土著种鱼类178种, 包括7目17科79属, 外来种22种, 并对流域内已知鱼类进行了详细论述。为了进一步查明金沙江中游鱼类资源现状及梯级开发对其产生的影响, 2021—2022年对金沙江中游干流开展了鱼类资源调查, 分析了金沙江中游干流的鱼类组成及群落结构特征, 探讨梯级开发对金沙江中游鱼类资源的影响, 以期为金沙江中游水电工程生态环境效应评价和管理提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 水电开发现状
通过查询文献资料, 结合主要河流水电规划环境影响报告书及各级政府对环境影响报告书的批复, 收集金沙江中游干流水电梯级主要指标及鱼类保护措施[5, 15]。
1.2 鱼类资源现状
于2021年12月(枯水期)、2022年3—4月(平水期)、2022年7—8月(丰水期)在金沙江中游干流开展鱼类资源调查。以梨园、阿海、金安桥、龙开口、鲁地拉、观音岩、金沙、银江8个干流梯级电站为中心, 选择已建梯级电站库中和库尾共14个代表性区域为采样断面, 在建的银江水电站选择金沙水电站坝下和三堆子水文站作为采样断面, 共计16个采样断面(表 1)。调查中使用的渔具包括三层定置刺网网(内层网目7.5 cm, 外层网目18 cm)及地笼(网目2 cm, 长5 m, 网高0.4 m)(按规定办理报批手续), 网具通常从头一天的16:00—18:00放置到第二天的8:00—10:00, 总计约16h。采集鱼类测量全长、体长(精确至1 mm), 称量体重(精确至0.1 g), 记录采样时间和采样地点等相关信息, 参考《四川鱼类志》[6]、《金沙江流域鱼类》[1]、《云南鱼类志》[7—9]等相关文献记载对鱼类物种进行现场鉴定。甲醛或无水乙醇浸泡固定无法准确鉴定的样本带回实验室鉴定, 并划分其生态类型。
表 1 金沙江中游鱼类资源调查站点信息Table 1. Survey sites information of fish resources survey in middle section of Jinsha River河段(代码)
River area调查站点(代码)
Sampling site东经
Longitude E北纬
Latitude N海拔
Altitude M梨园A 梨园库尾S1 100.2969 27.6613 1614 梨园库区S2 100.2358 27.3058 1670 阿海B 阿海库区S3 100.2963 27.7348 1529 阿海库尾S4 100.2963 27.7347 1583 金安桥C 金安桥库尾S5 100.5091 27.3280 1400 金安桥库区S6 100.4363 26.9930 1395 龙开口D 龙开口库尾S7 100.4381 26.7938 1311 龙开口库区S8 100.4113 26.5722 1279 鲁地拉E 鲁地拉库尾S9 100.4245 26.4774 1184 鲁地拉库区S10 100.8503 26.1691 1174 观音岩F 观音岩库尾S11 100.8504 26.1691 1134 观音岩库区S12 101.4358 26.5089 1117 金沙G 金沙库尾S13 101.4647 26.5335 1016 金沙库区S14 101.6305 26.5689 993 银江H 金沙坝下S15 101.6670 26.5616 985 三堆子S16 101.8397 26.5792 978 1.3 数据分析与处理
鱼类生态类型划分 参考历史资料[1, 7—9], 对调查区域鱼类的生境偏好、产卵类型和食性等进行统计后, 对其生态类型进行划分。根据鱼类对流水生境的喜好程度分为亲流性、广适性和静水性鱼类; 根据鱼类成年阶段的主要食物的组成分为植食性、肉食性和杂食性; 根据鱼卵类型分为漂流型、黏性型和沉性型3种类型。
相对重要性指数 根据数量百分比、生物量百分比和出现频率来计算相对重要性指数(Index of Relative Importance, IRI)进而判定金沙江中游鱼类群落物种优势度, 具体计算公式如下:
$$ {\rm{IRI}} = ({{N}}\text{%} + {{W}}\text{%})\times{{F}}\text{%} $$ (1) 式中, N%和W%分别为某种鱼类生物量占调查鱼类总数量和生物量的百分比, F%为该种鱼类在调查采样点出现的频率。本文将IRI数值大于1000的鱼类划分为优势种 [10]
鱼类多样性分析 采用Margalef丰富度指数(D)、Shannon多样性指数(H′)、Pielou均匀度指数(J)及Simpson指数(C)计算鱼类多样性指数, 各指数计算公式如下[11—13] :
$$ D = (S - 1)/{\rm{ln}}N \;\;\;\;\; $$ (2) $$ H' =- \sum\nolimits_{i=1}^s P_i {\rm{ln}}P_i $$ (3) $$ J = H/\log S \qquad \;\;\;\;\;$$ (4) $$ C = 1 - \sum\nolimits_{i=1}^s p_i^2 \;\;\;\;\;\;\;$$ (5) 式中, Pi为调查中第i个物种数量占鱼类总数的比例, S为调查到的鱼类物种数, N为调查中所有鱼类物种的数量。
鱼类组成相似度分析 为了比较不同河段鱼类群落组成的相似性, 在Primer6软件中以鱼类不同种类为指标, 进行组间平均聚类法(Group average linkage)、非度量多维度尺度分析(NMDS)和相似性分析检验(ANOSIM)[14]。
2. 结果
2.1 水电开发现状
金沙江中游河段方案为一库十级, 目前已建成观音岩、金安桥、阿海、鲁地拉、龙开口、梨园、金沙共7个梯级电站, 在建银江1个梯级电站, 共利用天然落差966 m, 装机容量22160 MW, 总库容485.07亿m3。依据《金沙江中下游河段梯级电站规划》[5]及《金沙江金沙水电站环境影响报告书》[15], 金沙江中游干流各梯级电站建设运行后, 流水生境萎缩, 在建梯级间仅保留金沙水电站库尾至观音岩坝址约8 km的天然河段。
2.2 鱼类资源现状
本次调查采集到鱼类47种(表 2), 共计1440尾, 总重217.53 kg, 隶属于3目9科34属。其中鲤形目鱼类最多, 隶属于3科25属34种, 占总种类数的73.52%; 鲇形目次之, 隶属于4科5属8种, 占23.52%; 鲈形目4科4属5种, 占11.76%。鲤形目中以鲤科鱼类为主, 隶属于20属27种, 占总种数的57.45%。本次调查到国家二级重点保护动物8种, 分别为长薄鳅(Leptobotia elongata)、圆口铜鱼(Coreius guichenot)、长鳍吻鮈(Rhinogobio ventralis)、金沙鲈鲤(Percocypris pingi)、四川白甲鱼(Onychostoma angusistomata)、细鳞裂腹鱼(Schizothorax chongi)、岩原鲤(Procypris rabaudi)和青石爬鮡(Euchiloglanis davidi)。
表 2 鱼类组成结构对比Table 2. Comparison of fish composition and structure指标Index 历史记录
Historic records[5]本次采集
This study数量对比
Number百分比对比
Percentage数量Number 百分比Percentage 数量Number 百分比Percentage 变化Variation 变幅Variation level 变化Variation 变幅Variation level 生境类型Habitat 亲流型 50 80.65 30 63.83 –20 –40.00 –16.82 –20.85 广流型 9 14.52 14 29.79 5 55.56 15.27 105.20 静水型 3 4.84 3 6.38 0 0.00 1.54 31.91 肉食性 18 29.03 12 25.53 –6 –33.33 –3.50 –12.06 食性Feeting habits 杂食性 34 54.84 28 59.57 –6 –17.65 4.74 8.64 植食性 10 16.13 7 14.89 –3 –30.00 –1.24 –7.66 漂流型 14 22.58 9 19.15 –5 –35.71 –3.43 –15.20 繁殖习性Reproductive habits 沉性型 27 43.55 16 34.04 –11 –40.74 –9.51 –21.83 粘性型 21 33.87 22 46.81 1 4.76 12.94 38.20 2.3 资源分布
研究河段渔获物统计结果见图 1, 重量丰度和数量丰度均在鲁地拉(E)河段最高, 分别为311 g/h和2.8 ind/h, 金沙江中游鱼类物种数量总体上呈现出随着河流梯级向下呈现逐渐增加趋势。在金沙江中游干流8个河段分别调查到8、13、14、14、23、30、31和18种鱼类, 分别占鱼类种类总数的19.15%、27.66%、29.79%、48.94%、63.83%、36.17%、65.96%和38.30%。其中麦穗鱼、短须裂腹鱼和细鳞裂腹鱼3种鱼类在金沙江中游8个河段中均有分布; 细尾高原鳅[Triplophysa (Triplophysa) stenura]仅在梨园河段调查到; 草鱼(Ctenopharyngodon idellus)1种鱼类仅在阿海河段调查到; 秀丽高原鳅[Triplophysa (Triplophysa) venusta]仅在鲁地拉河段调查到; 张氏䱗(Hemiculter tchangi Fang)仅在观音岩河段调查到; 西昌白鱼(Anabarilius liui liui)、团头鲂(Megalobrama amblycephala)、翘嘴鲌(Culter alburnus)、黑鳍鳈(Sarcocheilichthys nigripinnis)、大口鲇(Silurus meridionalis)、粗唇鮠(Leiocassis crassilabris)、乌鳢(Channa argus) 7种鱼类仅在金沙河段调查到; 红鳍原鲌、镜鲤、短身金沙鳅3种鱼类仅在银江河段调查到。
2.4 优势种
对金沙江中游的主要渔获物的生物量和数量进行分析发现, 金沙江中游小型鱼类主要以棒花鱼(Abbottina rivularis)、高体鳑鲏、麦穗鱼等为主, 棒花鱼、高体鳑鲏的平均体重分别为4.27、2.32和3.90 g, 主要出现于龙开口以下河段; 中大型鱼类主要以细鳞裂腹鱼、短须裂腹鱼等裂腹鱼为主, 细鳞裂腹鱼、短须裂腹鱼的平均体重分别为176.59和152.70 g, 且在所有河段均有分布。相对重要性指数(IRI)计算结果表明, 金沙江中游段IRI优势种分别为细鳞裂腹鱼(2558.13)、短须裂腹鱼(1911.99)、齐口裂腹鱼(Schizothorax prenanti)(1404..04), 占调查鱼类总生物重量的27.07%, 占调查鱼类渔获物数目总数的53.69%。
2.5 鱼类生态类型
按照生态学特征对金沙江中游鱼类进行分类, 金沙江中游鱼类以杂食性、产沉性卵及亲流型鱼类为主, 栖息类型划分, 亲流型鱼类30种, 占63.83%; 广流型鱼类14种类, 占29.79%; 静水型鱼类3种, 占6.38%, 按食性划分, 肉食性鱼类12种, 占25.53%; 杂食性鱼类28种, 占59.57%; 植食性鱼类7种, 占14.89%; 按繁殖习性划分, 产漂流性卵鱼类9种, 占19.15%; 产沉性卵鱼类16种, 占34.04%; 产黏性型卵鱼类22种, 占46.81%(表 2)。
2.6 群落多样性指数
Shannon-Wiener 指数、Simpson 指数、Margalef指数、Pielou 指数分别为1.04—2.38、0.57—0.88、1.11—3.42和0.68—0.90。从空间上看, 将8个河段的Shannon多样性指数(H′)、Simpson指数(C)、Margalef丰富度指数(D)及Pielou均匀度指数(J)等四个群落多样性指数进行方差齐性检验, 发现其P值均大于0.05, 因此采用LSD法进行多重比较, 结果表明Margalef丰富度指数(D)、Shannon多样性指数(H′)、Pielou均匀度指数(J)及Simpson指数(C)在8个河段间存在显著差异(P<0.05)。从上游至下游鱼类群落多样性总体上呈现出逐渐增加的趋势(表 3)。
表 3 金沙江中游各河段鱼类多样性指数分析与比较Table 3. Comparison of fish community diversity in the different sections of Jinsha River河段
Reach多样性指数 Diversity index Shannon Simpson Margalef Pielou A 河段Reach A 1.04±0.48a 0.57±0.21a 1.11±0.43a 0.82±0.09ab B 河段Reach B 1.24±0.30ab 0.60±0.14ab 1.37±0.20ab 0.70±0.15ab C 河段Reach C 1.19±0.19ab 0.62±0.06ab 1.37±0.24ab 0.68±0.14a D 河段Reach D 1.66±0.63ab 0.69±0.21ab 2.30±0.96ab 0.72±0.13ab E 河段Reach E 2.38±0.16b 0.88±0.02b 3.42±0.25c 0.83±0.05ab F 河段Reach F 1.77±0.16ab 0.78±0.06ab 2.32±0.22b 0.84±0.08ab G 河段Reach G 1.87±0.18ab 0.79±0.05ab 2.62±0.23b 0.79±0.10ab H 河段Reach H 2.04±0.10b 0.84±0.02ab 2.80±0.71bc 0.90±0.07b 注: 同列数据后面不同小写字母表示其差异显著(P<0.05)Note: Different lowercase letters after the same column of data indicate significant differences (P<0.05) 2.7 鱼类组成相似度
根据聚类分析、NMDS排序分析结果表明(图 2), 当相似性系数为25.96时, 整个流域可分为3组: 聚类组Ⅰ包括梨园、阿海、金安桥、龙开口河段, 聚类组Ⅱ包括鲁地拉、金沙河段, 聚类Ⅲ组包括观音岩、银江河段。NMDS排序图与聚类分析图一致, 压力系数(Stress)为0.08。ANOSIM分析表明, 金沙江中游流域鱼类群落的组件差异显著(R=0.76, P<0.5), 因此这样划分是可行的。
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图 2 金沙江中游各河段鱼类群落相似性Figure 2. Similarity of fish communities in the middle Jinsha River根据SIMPER分析结果表明, 聚类组Ⅰ和聚类组Ⅱ的平均相异性为79.58%, 导致Ⅰ和Ⅱ组间相异性的指示种有麦穗鱼、高体鳑鲏、棒花鱼、齐口裂腹鱼、短须裂腹鱼、细鳞裂腹鱼、䱗和鲫; 聚类组Ⅰ和聚类组Ⅲ的平均相异性为74.77, 导致Ⅰ和Ⅲ组间相异性的指示种有齐口裂腹鱼、短须裂腹鱼、细鳞裂腹鱼、䱗、圆口铜鱼和长丝裂腹鱼; 聚类组Ⅱ和聚类组Ⅲ的平均相异性为79.58%, 导致Ⅱ和Ⅲ组间相异性的指示种有麦穗鱼、高体鳑鲏、棒花鱼、短须裂腹鱼、细鳞裂腹鱼和白甲鱼(表 4)。
表 4 引起各组群落差异的主要种类(仅列出5%以上的种)Table 4. The main fish species contribute to the dissimilarity in different groups指示种Indicator species 组Ⅰ&组Ⅱ 组Ⅰ&组Ⅲ 组Ⅱ&组Ⅲ 麦穗鱼 10.37 11.79 高体鳑鲏 10.05 11.67 棒花鱼 8.08 9.09 齐口裂腹鱼 6.49 14.41 短须裂腹鱼 6.36 7.41 7.25 细鳞裂腹鱼 5.82 11.38 9.48 䱗 5.76 8.95 鲫 5 圆口铜鱼 12.04 长丝裂腹鱼 7.51 白甲鱼 5.49 3. 讨论
3.1 鱼类资源现状
本次调查结果显示, 金沙江中游鱼类3目9科34属47种, 将顾洪宾等[9]调查的62种鱼类作为本底, 研究鱼类资源的变化情况。对比其渔获物组成, 所有河段鱼类种类数均呈现下降趋势(图 3), 本研究调查到新增鱼类12种类, 其中包括岩原鲤1种国家级保护动物; 有种28种本研究未采集到, 其中有厚唇裸重唇鱼、四川白甲鱼、青石爬鮡3种国家级保护动物, 食蚊鱼、贝氏䱗等2种外来鱼类。
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图 3 金沙江中游不同时期鱼类种类调查成果图2010年以前数据为历史数据, 2020年以后为本次调查结果Figure 3. Survey results of fish species in different periods in the middle reaches of Jinsha RiverThe data before 2010 are historical data, and the results of this survey are from 2020 onwards金沙江中游海拔差异大, 原以流水河段为主, 以裂腹鱼、圆口铜鱼、高原鳅等亲流型鱼类为主, 广适型和静水型鱼类较少[9], 而金沙江中游各梯级建成后, 流水变为静水或缓流河段, 流速、流量等生境变化会导致广适型和静水型鱼类比例增加[16], 亲流型鱼类比例变小, 此外, 圆口铜鱼等产漂流性卵的鱼类产卵场被淹没, 也导致导致产漂流型卵鱼类减少[1]。
根据鱼类群落相似性分析, 金沙江中游干流鱼类群落可分为三组, 组Ⅰ包括梨园、阿海、金安桥、龙开口河段, 组Ⅱ包括鲁地拉、观音岩河段, 组Ⅲ包括金沙、银江河段, 造成河段间鱼类群落差异的原因可能有: (1)梨园至银江各河段间海拔落和干流形态差异较大[1], 龙开口以上河段两岸多为高山峡谷, 河道多由深潭跌水环环相扣, 流速较快, 鲁地拉及以下河段总体顺直, 河流落差小, 水流平缓等, 且随着海拔的不断升高, 水体温度逐渐降低, 可能是造成鱼类群落差异的重要原因。(2)根据现场走访, 金沙江中游大具河、塘坝河等部分支流上游电站无生态流量泄放要求, 导致坝下河段几乎成为脱水河段, 河流连通性受阻, 导致本该因支流水量汇入保持流水生境的干流河段变少, 干流流水生境的改变也可能造成各河段间的鱼类群落差异。
3.2 梯级开发对鱼类的影响分析
2004年金中规划环评通过以来, 自2009年底金安桥首台机组投产至2020年11月金沙首台机组投产, 金沙江中游已建成7座相连的水电站, 中游干流约63%的河段由河流变为水库。河流变为水库后, 河流形态, 水文情势发生极大改变, 水位变深, 流速减缓, 7座大坝将原本一体的中游河道分为8段, 原江段以急流为主要流态特征的不间断河流形态变为以静缓流为主要流态特征的间断性水库形态, 原河流连续性生态系统转变为片段式水库-湖泊生态系统[1, 14, 17]。由于水库的淹没和大坝的阻隔, 梯级开发后可能带来的影响可归纳为以下几个方面:
(1)梯级开发所建闸坝阻断河道后, 阻断了鱼类的天然洄游通道, 上行通道被阻隔, 下行路径及方式也被改变, 产漂流性卵和长距离洄游性鱼类没有足够的空间完成其生活史, 种群间得不到有效的交流。多年研究表明[1], 一些特有产漂流性卵鱼类如圆口铜鱼, 产卵场主要在集中在金沙江中游干流, 随着各梯级库区的形成, 圆口铜鱼的产卵场已被或正被淹没。已有研究表明[1, 14, 18]圆口铜鱼种群的遗传多样性降低, 受已建大坝的影响, 已出现种群裂化的趋势, 该物种可能在金沙江中游无法维持其种群的繁衍[28] 。
(2)大型水利工程修建导致坝下江段水位、流速、流量等变化幅度降低[19], 而流量量级等水文要素的改变, 对鱼类多样性和群落结构的时空变化造成明显的影响[20—22]。因河流湖库化, 鱼类原有的生长及繁殖环境产生巨大改变, 原本的土著亲流型鱼类将退缩至减水河段、支流或上游区域。以二滩水电站为例, 雅砻江水系的土著鱼类多数适应河流流水环境, 鱼类种类组成以裂腹鱼类、高原鳅类等适应急流生境类群为主; 在二滩水库形成后, 适应急流生境的土著鱼类被迫迁移至水库库尾和支流中, 库区土著鱼类的资源量显著下降, 裂腹鱼类的重量百分比由建库前的71.9%下降至建库后的16.0%。
(3)水库蓄水后, 库区水体加深、水流减缓, 形成了一个生态位空缺的人造湖泊生态系统[23]。水库蓄水初期阶段由于水体营养动力学的改变。通常利于广适型鱼类和外来物种的生存, 正如调查结果显示的鲫、高体鳑鲏、麦穗鱼、棒花鱼等[24, 25]鱼类, 这些鱼类在与土著鱼类的生态位竞争中胜出, 种群密度提高, 并逐渐成为优势种群, 对土著鱼类群落乃至整个区域渔业生态系统造成严重影响。
3.3 保护建议
加强支流保护, 落实保护措施 栖息地保护是保护鱼类自然资源的有效措施, 金沙江中游从石鼓到雅砻江口干流长约563.5 km, 而金沙江中游梯级兴建后, 仅保留了金沙水电站库尾至观音岩坝址约8 km的天然河段, 流水生境的连续性遭到严重破坏, 干流流水生境面积显著缩小已成定局。而水洛河等支流有大量水量汇入, 对维持干流流水生境起着至关重要的作用, 因此支流的流水生境保护显得尤为重要, 不仅能够为一些流水性鱼类, 如长丝裂腹鱼、短须裂腹鱼、硬刺松潘裸鲤、圆口铜鱼等鱼类提供完成整个生命史的条件, 又为需要在流水中产黏沉性卵的鱼类提供了繁殖场, 为鱼类提供足够的摄食场地、繁殖场、生长空间和庇护所[26—28]。根据现场走访, 目前金沙江中游支流保护情况严峻, 多数支流等受水利开发等影响较大, 河流连通性受阻, 流量减少严重, 难以满足基本生态流量下泄要求。
水洛河为阿海库尾左岸一级支流, 也是金沙江中游规模最大的支流。水洛河水量丰沛, 多年平均流量201 m3/s, 年径流量63.4×108m3, 为四川省中型河流中径流量较大的河流之一, 能为金沙江中游干流带来充足的水量, 供干流维持流水生境。河谷宽窄相间, 河流形态多样, 漫滩、深潭、激流交错, 底质为卵石、巨石和砾石、沙泥, 有利于鱼类资源的生存繁衍, 是鱼类良好的栖息地[29]。水洛河鱼类资源丰富, 分布有多种珍稀特有鱼类, 本研究在阿海库尾-库区段共捕获了国家二级保护动物圆口铜鱼49尾, 占该江段渔获物比重的38%, 是目前金沙江中游流域圆口铜鱼分布最多的江段, 保护水洛河对圆口铜鱼等亲流型珍稀鱼类具有重要意义。目前水洛河规划的最末梯级捷可水电站尚未建成, 已建最末梯级撒多水电站厂址以下至河口有约21 km的天然河段和阿海库尾流水河段连通, 是目前金沙江中游最理想的鱼类栖息地, 然而水洛河规划的最末梯级捷可水电站其坝址高程与阿海水电站正常蓄水位高程基本衔接, 捷可水电站建成后水洛河将基本没有天然河段, 且水量损失严重, 丧失其保护价值。建议停止捷可水电站的开发, 对水洛河撒多水电站坝址以下约40 km河段开展就地保护, 由渔业主管部门设置鱼类栖息地保护区。
加强渔政管理, 规范放生行为 本次调查研究共发现草鱼、红鳍原鲌、鲢、麦穗鱼、棒花鱼、高体鳑鲏、鲤、鲫、子陵吻虾虎鱼、波氏吻虾虎鱼、团头鲂、翘嘴鲌、黑鳍鳈、尼罗罗非鱼14种外来鱼类[1, 24, 25], 且麦穗鱼、棒花鱼、高体鳑鲏已成为金沙江中游干流优势种。水库是各种外来鱼类物种扩散的来源地[24], 水库建成后，水库上游河段外来鱼类物种丰度的明显增加, 外来鱼类可能会产生种群生态位竞争及种间杂交, 对流域鱼类组成结构产生影响。因此应加大渔业环保宣传力度, 制定合理法规, 正确引导民间放生, 杜绝外来物种入侵的人为引入。
加强科学研究, 统筹保护措施 圆口铜鱼等鱼类为长江上游重要的珍稀鱼类, 经济价值高, 但由于环境的改变导致其资源量下降严重, 应该加强对圆口铜鱼等稀有鱼类的行为学、繁殖生物学等基础研究; 其次, 鱼类增殖放流为金沙江中游各梯级电站的主要鱼类保护措施, 因此应加强对增殖放流效果、增殖放流对鱼类遗传多样性的评估, 保证增殖放的有效性[25]。
梯级开发所建闸坝阻断河道后, 阻断了鱼类的天然洄游通道, 上行通道被阻隔, 妨碍了上下游鱼类群落间的基因交流, 对漂流性卵和长距离洄游性鱼类有巨大的影响。目前金沙江中游除金沙和龙开口水电站外, 均以网捕过坝为主, 建议在系统评估现有措施的基础上, 优化河流连通性恢复或加强梯级上下游鱼类交流的方式方法[30]。
金沙江中游水生生物保护对策的实施, 需要在长期而系统地研究梯级水库生态特点的基础上, 以长期动态生态监测为依托, 从河流生态环境整体出发, 形成干流上下游、干流、支流统筹保护、恢复及改造生境格局, 对鱼类资源进行分段保护, 对栖息地保护、增殖放流等保护措施合理规划和布局, 结合生境修复、生态调度和补建过鱼设施等辅助措施, 对金沙江中游梯级水库实施系统生态管理, 以维持良好生态环境。
(作者声明本文符合出版伦理要求)
附表 S1 金沙江中游鱼类分布及生态类型Appendix S1. Fish species distrutution and ecological type in Jinsha River学名
Scientific name分布河段Distribution reach 梨园
Reach A阿海
Reach B金安桥
Reach C龙开口
Reach D鲁地拉
Reach E观音岩
Reach F金沙
Reach G银江
Reach H生态类型
Ecological type鲤形目Cypriniformes 鲤科Cyprinidae 雅罗鱼亚科Leuciscinae ★草鱼Ctenopharyngodon idellus◆ + Dr; P; R 鲢亚科Hypophthalmichthyinae ★鲢Hypophthalmichthys molitrix◆ + + + + Dr; O; R 鱊亚科Acheilognathinae 高体鳑鲏Rhodeus sinensis◆ + + + + +D + V; O; R 鲌亚科Cultrinae 䱗Hemiculter leucisculus + +D + + V; O; R 张氏䱗 Hemiculter tchangi Fang + V; O; G ★西昌白鱼Anabarilius liui liui + D; O; G ★团头鲂Megalobrama amblycephala◆ + V; O; S ★翘嘴鲌Culter alburnus◆ + V; C; R ★红鳍原鲌 Cultrichthys erythropterus◆ + V; C; R 野鲮亚科Labeoninae 泉水鱼Semilabeo prochilus + + + + D; O; R 鮈亚科Gobioninae 麦穗鱼Pseudorasbora parva◆ + + + + + + +D + V; O; S 圆口铜鱼Coreius guichenoti +D + +D + Dr; O; R 棒花鱼Abbottina rivularis ◆ + + + + + + D; C; S 蛇鮈Saurogobio dabryi + + + Dr; O; R 长鳍吻鮈Rhinogobio ventralis + + Dr; P; R ★黑鳍鳈Sarcocheilichthys nigripinnis + D; O; G 鲃亚科Barbinae 金沙鲈鲤Percocypris pingi pingi + + + + + + D; C; R 白甲鱼Onychostoma sima + + V; P; R 裂腹鱼亚科Schizothoracinae 短须裂腹鱼Schizothorax wangchiachii + + + +D +D +D + + D; P; R 长丝裂腹鱼Schizothorax dolichonema +D +D + + + + V; O; R 齐口裂腹鱼Schizothorax prenanti + + +D + + + D; P; R 细鳞裂腹鱼Schizothorax chongi +D + +D +D +D + + + V; O; R 四川裂腹鱼Schizothorax kozlovi Nikolsky +D + + + + V; O; R 鲤亚科Cyprininae 岩原鲤Procypris rabaudi + + + V; O; G 鲤Cyprinus (Cyprinus) carpio ◆ + + + + + + D; O; G ★镜鲤Cyprinus carpio var + D; O; G 鲫Carassius auratus auratus ◆ + + +D + + +D V; O; G 鳅科Cobitidae 条鳅亚科Nemacheilinae D; O; R 细尾高原鳅Triplophysa (Triplophysa) stenura + D; O; R ★秀丽高原鳅Triplophysa (Triplophysa) venusta + D; O; R 沙鳅亚科Botiinae 长薄鳅Leptobotia elongata + + Dr; C; R 花鳅亚科Gobitinae 泥鳅Misgurnus anguillicaudatus + + + + V; O; G 平鳍鳅科Homalopteridae 平鳍鳅亚科Homalopterinae 犁头鳅Lepturichthys fimbriata + + Dr; P; R 中华金沙鳅Jinshaia sinensis + + + Dr; P; R 短身金沙鳅Jinshaia abbreviata + Dr; O; R 鲇形目Siluriformes 鲇科Siluridae 鲇Silurus asotus + + + + V; C; G 大口鲇Silurus meridionalis + V; C; G 鲿科Bagridae ★黄颡鱼Pelteobagrus fulvidraco + + + + V; O; R 瓦氏黄颡鱼Pelteobagrus vachelli + + +D V; O; R ★光泽黄颡鱼Pelteobagrus nitidus + + + V; O; R 粗唇鮠Leiocassis crassilabris + V; O; R 钝头鮠科Amblycipitidae 白缘䱀Liobagrus marginatus + + + + + D; C; R 鮡科Sisoridae 中华纹胸鮡Glyptothorax sinense + + + + D; O; R 鲈形目Perciformes 沙塘鳢科Eleotridae 小黄䱂鱼Micropercops swinhonis + + + V; C; G 慈鲷科Cichlidae ★尼罗罗非鱼Oreochromis niloticus◆ + + D; O; G 鳢科Channidae ★乌鳢Channa argus + V; C; S 鰕鯱鱼科Gobiidae 子陵吻虾虎鱼Rhenogobius giurinus ◆ + + + D; C; G 波氏吻虾虎鱼Rhenogobius cliffordpopei◆ + + D; C; G 总物种数Total species 9 13 14 23 30 17 31 18 注: “★”表示该物种为新增种; “+”表示该物种出现; “+D”表示该为优势种; ◆ 表示外来物种; Dr. 漂流型; D. 沉性型; V. 黏性型; C. 肉食性; O. 杂食性; P. 植食性; R. 亲流型; G. 广适型; S. 静水型Tip: “★” denotes new specie , “+” denotes ovserved specie, “+D” denotes the dominant species, ◆ indicates alien species, Dr. Drift; D. Demersal; V. viscous; C. carnivorous; O. omnivorous; P. Herbivore; R. Riffle; G. Eurytopic; S. slow current 附表 S2 金沙江中游各梯级电站主要指标及保护措施表Appendix S2. Similarity of fish communities in the middle Jinsha River项目 流域面积
(km2)正常蓄水位
(m)死水位
(m)总库容
(m3)回水长度
(km)装机容量
(MW)实施情况 栖息地保护措施 过鱼措施 过鱼目标 龙盘 21.84 2010 1939 385.15 265 4200 未建 两家人 21.84 1790 1790 0.0146 2 3250 未建 梨园 22.01 1618 1605 8.05 58 2400 已建 将干流两家人坝址至厂房间约18 km的流水江段建立鱼类资源保护区。对格基河支流最后一级电站下只恩电站坝下9 km的河段规划建立鱼类生境保护区。 网捕过坝 长丝裂腹鱼、短须裂腹鱼、鲈鲤、四川裂腹鱼、硬刺松潘裸鲤、中华金沙鳅 阿海 23.54 1504 1492 8.79 75.3 2000 已建 在支流水洛河、翠依河和金棉河建立珍稀鱼类自然保护区, 网捕过坝 无具体捕捞目标 金安桥 23.74 1418 1398 9.13 100.1 2400 已建 金安桥水电站水库区及坝下分布的黑白水河、五郎河、漾弓江等主要支流已被开发利用, 建有水坝不再推荐就地保护措施。 网捕过坝 金沙鲈鲤、圆口铜鱼、鲇鱼、江黄颡鱼、墨头鱼、齐口裂腹鱼、短须裂腹鱼、四川裂腹鱼、长须裂腹鱼、长丝裂腹鱼、细鳞裂腹鱼、长鳍吻鮈、长薄鳅 龙开口 23.97 1298 1290 5.58 41.4 1800 已建 加强中江河(漾弓河)等支流生境的保护。 网捕过坝、集运鱼 短须裂腹鱼、鲈鲤、细鳞裂腹鱼、长鳍吻鮈、中华金沙鳅和长薄鳅 鲁地拉 24.73 1223 1212 17.18 99.1 2160 已建 渔泡江和漾弓江流量较大, 流程长, 是较好的鱼类栖息地, 建议停止开发小水电, 建立鱼类栖息地。 捕捞过坝 西昌白鱼、裸体异鳔鳅鮀、鲈鲤、短须裂腹鱼、长丝裂腹鱼、细鳞裂腹鱼、四川裂腹鱼、前鳍高原鳅、西昌华吸鳅、白缘、前臀鮡 观音岩 25.65 1134 1126 22.5 96 3000 已建 将渔泡江和塘坝河, 马过河保留的10 km天然河道作为支流保护河段; 在观音岩电站库尾、坝下以及支流马过河和塘坝河等具有一定的流水河段建立人工产卵场。 网捕过坝 圆口铜鱼、长鳍吻鮈、裸体异鳔鳅鮀、金沙鲈鲤、短须裂腹鱼、长丝裂腹鱼、四川裂腹鱼、软刺裸裂尻鱼、前鳍高原鳅、长薄鳅、白缘、前臀鮡、四川白甲鱼、岩原鲤 金沙 25.89 1022 1021 1.08 28.9 560 已建 未对栖息地保护提出要求 鱼道 胭脂鱼、圆口铜鱼、长薄鳅、长鳍吻鮈、岩原鲤、鲈鲤、四川白甲鱼、泉水鱼 银江 25.93 998.5 998 0.594 21.39 390 在建 未对栖息地保护提出要求 鱼道 胭脂鱼、鲈鲤、四川白甲鱼、圆口铜鱼、岩原鲤、长薄鳅、长鳍吻鮈、吻鮈、泉水鱼 -
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图 1 副溶血弧菌生物膜形成测定
A. 结晶紫染色法定量测定培养24h的生物膜形成量; 横坐标代表不同副溶血弧菌菌株, WT为野生型菌株, Control为培养基对照, 纵坐标代表 595的吸光值; 荧光染色观察生物膜形成; B. 副溶血弧菌不同菌株在盖玻片上培养12h后用SYTO-9染色, 用40倍物镜下荧光显微镜观察; *P<0.05, n.s. 无显著差异
Figure 1. Vibrio parahaemolyticus biofilm formation assay
A. Crystal violet staining is used to quantitatively measure the amount of biofilm formation after 24h of culture; The horizontal axis represents different Vibrio parahaemolyticus strains, WT is the wild type strain, Con is the medium control, and the vertical axis represents the absorbance value of 595; B. Biofilm formation was observed by fluorescence staining. Different strains of Vibrio parahaemolyticus were cultured on cover slides for 12h before staining with SYTO-9 and observed under a fluorescence microscope with a 40× objective; *P<0.05, n.s. no significant difference
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图 2 结晶紫染色测定不同时间点副溶血弧菌生物膜形成
横坐标代表不同时间点, 纵坐标代表 595的吸光值; WT为野生型菌株, Control为培养基对照; 统计分析来源于 3 组数据, 数值用平均数表示
Figure 2. Determination of biofilm formation of Vibrio parahaemolyticus at different time points by crystal violet staining
The horizontal axis represents the absorbance value of 595 at different time points, and the vertical axis represents the absorbance value of 595; WT is the wild-type strain and Control is the medium control; The data are expressed as mean±SE from three independent experiments
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图 3 副溶血弧菌不同菌株的在CR平板上菌落形态
Figure 3. Colony morphology of different strains of Vibrio parahaemolyticus on CR plates
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图 4 副溶血弧菌cps基因簇基因的转录水平分析
将不同菌株接种于含LB+2% NaCl的无菌玻璃管中, 培养12h, 检测cpsA、cpsB、cpsC、cpsD和cpsQ的表达水平; 氯霉素用于维持WT:pscvL菌株中的质粒, 内参基因为rpoA, *P<0.05
Figure 4. Transcript Level Analysis of cps gene cluster genes in Vibrio parahaemolyticus
Different strains are inoculated in sterile glass tubes containing LB+2% NaCl and cultured for 12h. The expression levels of cpsA, cpsB, cpsC, cpsD, and cpsQ are detected. Chloramphenicol is used to maintain the plasmid in the WT: pscvL strain, and the reference gene is rpoA, *P<0.05
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图 5 副溶血弧菌胞外多糖测定
A. 不可溶胞外多糖的测定; B. 可溶性胞外多糖的测定; *P<0.05
Figure 5. Vibrio parahaemolyticus exopolysaccharide assay
A. Determination of insoluble exopolysaccharides; B. Determination of soluble exopolysaccharides; *P<0.05
表 1 本文所使用的菌株和质粒
Table 1 The strains and plasmids used in this study
名称Name 特征描述Characterization 来源Source 副溶血弧菌 SHY1833 pirA+/pirB+, 2017年分离于患AHPNS对虾 [13] ΔscvL SHY1833的scvL基因敲除株 本研究 ΔscvH SHY1833的scvH基因敲除株 本研究 ΔcpsA SHY1833的cpsA基因敲除株 本研究 ΔscvL:pscvL SHY1833的scvL基因回补株 本研究 WT:pscvL SHY1833的scvL基因过表达菌株 本研究 大肠杆菌 S17-1 λpir Thi pro hsdR hsdM+ recA RP4-2-Tc::Mu-Km::Tn7λpir 接合供体菌 [14] S17:pDM4_∆scvL (A1+A2) S17-1携带pDM4_∆scvL (A1+A2)质粒 本研究 S17:pDM4_∆scvH (A1+A2) S17-1携带pDM4_∆scvH (A1+A2)质粒 本研究 S17:pDM4_∆cpsA (A1+A2) S17-1携带pDM4_∆cpsA (A1+A2)质粒 本研究 质粒 pDM4 Cmr, 含依赖π蛋白oriP6K复制子和sacBR基因的自杀质粒 [15] pBBR1MCS-1 Cmr, 广宿主表达质粒 [16] pDM4_∆scvL (A1+A2) 插入有scvL两端同源臂的pDM4自杀质粒 本研究 pDM4_∆scvH (A1+A2) 插入有scvH两端同源臂的pDM4自杀质粒 本研究 pDM4_∆cpsA (A1+A2) 插入有cpsA两端同源臂的pDM4自杀质粒 本研究 pscvL 插入有scvL的pBBR1MCS-1表达质粒 本研究 
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表 2 本文所使用的引物
Table 2 The primers used in this study
引物名Primer name 引物序列Primer sequence (5′—3′) 用途Purpose scvL-pDM4-F1 cgcatgcaagatctatctagaTTGTCTGACTGGCTGGAC 扩增scvL上下游侧翼序列 scvL-pDM4-R1 TGCCAGTTCATGGAACGAGCTTGCTTAC scvL-pDM4-F2 GCTCGTTCCATGAACTGGCAGATAACTCG scvL-pDM4-R2 cactagtggggcccttctagaCATTTCGCTAAGGATTGG scvL-cF ACTATGAGCGATTTACGAGA scvL敲除检测 scvL-cR ACTTTAGGCAAGGTGGTG scvH-pDM4-F1 cgcatgcaagatctatctagaTTCCTTTCGGTTGGTTCG 扩增scvH上下游侧翼序列 scvH-pDM4-R1 CGTTGTTTCGTGCTCGGGCTTTGTTGTC scvH-pDM4-F2 AGCCCGAGCACGAAACAACGTCAAAGGA scvH-pDM4-R2 cactagtggggcccttctagaCACATACCCACTGCGAAC scvH-cF ATGGCTGGACTGCTGAAT scvH敲除检测 scvH-cR ATACCCACTGCGAACTTAA cpsA-pDM4-F1 cgcatgcaagatctatctagaCTCCGCACCCAAGACTAAA 扩增cpsA上下游侧翼序列 cpsA-pDM4-R1 AAGGAAGATGCCCGACGAAGGACAAGATG cpsA-pDM4-F2 CTTCGTCGGGCATCTTCCTTACCGTGTTC cpsA-pDM4-R2 cactagtggggcccttctagaCGATAATCCACGACTAAAC cpsA-cF AAGTCATCCGTTAGACCA cpsA敲除检测 cpsA-cR CAATGCCAGATTCAGTTT scvL-pBBR-F cgcggtggcggccgctctagaAACCAAAACCGACGGGTAAAG 扩增scvL的ORF及上游1000bp序列 scvL-pBBR-R gggggatccactagttctagaTTAACTGGCGAACGTCACTTTAGG RT-cpsA-F TACCGTTTTGGCCTATTTGC qPCR分析cpsA转录 RT-cpsA-R ATTTGATCCCAGCGAGAATG RT-cpsB-F TCGTTTAGGCGGCATTTATC qPCR分析cpsB转录 RT-cpsB-R CGCTTACCGTCCAGACATTT RT-cpsC-F CCCTTACCTTGGACGAATCA qPCR分析cpsC转录 RT-cpsC-R GCTAGTGCGATGGCTTTTTC RT-cpsD-F TCGACGACATCAAAGCAGTC qPCR分析cpsD转录 RT-cpsD-R ATCGGCAGAACGAAAGCTAA RT-cpsQ-F TGGCTTGCGTCCTATTTTTC qPCR分析cpsQ转录 RT-cpsQ-R GAGGATTAGGGGCCATTGTT RT-rpoA-R TCGCCGCATTCTTCTATCTT qPCR分析rpoA转录 RT-rpoA-R TCAGCGTTGTCATCCGTTAG
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