NEGATIVE REGULATORY EFFECT OF SCVL ON BIOFILM FORMATION OF VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS
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摘要:
为探讨scvL在副溶血弧菌生物膜形成中发挥的具体作用, 本研究以导致凡纳滨对虾急性肝胰腺坏死症的副溶血弧菌菌株SHY1833为对象, 通过基因敲除和回补技术构建了scvL的缺失突变株ΔscvL, 回补株ΔscvL: pscvL和过表达株WT: pscvL, 同时构建胞外多糖基因簇基因cpsA的缺失突变株ΔcpsA作为对照。利用结晶紫染色和SYTO-9荧光测定生物膜形成量显示, 缺失scvL后明显促进了SHY1833 生物膜形成量, 相反, 过表达scvL抑制了生物膜形成; 与预期结果一致cpsA缺失导致生物膜形成量下降; 这说明scvL对副溶血弧菌生物膜形成发挥负调控作用。菌落形态观察表明 scvL缺失还导致SHY1833菌落呈皱褶且不透明表型。利用qPCR分析显示scvL缺失造成了胞外多糖合成基因簇基因的转录上调, 进一步, 采用苯酚硫酸法测定胞外多糖揭示其胞外分泌的不可溶性多糖的明显增多。研究结果为揭示scv基因簇在副溶血弧菌生物膜形成中的作用机制提供了基础。
Abstract:Vibrio parahaemolyticus is considered to be one of the threatening pathogens for marine animals, which caused huge annual economic losses to the aquaculture. Biofilm formation, a bacterial defense strategy against environmental threats, contribute to the colonization and survival of V. parahaemolyticus during infection of host. Recent study reported that a gene cluster called scv (syp-like locus in V. parahaemolyticus) was found to be involved into V. parahaemolyticus biofilm production, however, the role of most genes in scv gene cluster, including scvL remains to be elucidated. In this study, V. parahaemolyticus strain SHY1833 was isolated from diseased Pacific white leg shrimp (Litopenaeus vannamei) that exhibited acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND). In order to explore the function of scvL in biofilm formation, the in-frame deletion mutant (ΔscvL) was constructed using the allelic exchange method. Additionally, a complemented strain (ΔscvL: pscvL) and an over-expressed strain (WT: pscvL) were generated by introducing pBBR-scvL into the ΔscvL mutant and the wild-type SHY1833 (WT), respectively. Meanwhile, the cpsA deleted mutant (ΔcpsA) was also made as a control for affecting biofilm formation. Crystal violet staining and SYTO-9 fluorescence assays showed that the scvL deletion significantly increased biofilm formation, while scvL overexpression decreased it. As expected, cpsA deletion resulted in decreased biofilm formation. Therefore, it can be concluded that scvL negatively affected the biofilm formation in strain SHY1833 of V. parahaemolyticus. Additionally, the colony morphology was also examined on Congo red plate, revealing that the colonies of ΔscvL were more opaque and rugose compared with that of WT strain. qPCR analysis showed that the transcriptional level of a number of cps genes was considerably elevated in the scvL deletion strain and downregulated in the scvL-overexpressed strain when compared to the WT strain. Consistently, phenol-sulfuric acid methods for determination of expolysaccharide showed that the deletion of scvL caused the significant increase in extracellular insoluble polysaccharides. In summary, these results offer a basis for clarifying how the scv gene cluster contributes to V. parahaemolyticus biofilm development.
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Keywords:
- scvL /
- Biofilm /
- Regulation /
- Extracellular polysaccharides /
- Vibrio parahaemolyticus
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副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus, VP)隶属于弧菌科(Vibrionaceae)弧菌属(Vibrio), 是一种广泛存在于海洋及河口等环境中的革兰氏阴性细菌, 因食用受副溶血弧菌污染水产品或者伤口直接接触副溶血弧菌, 引起感染并导致急性肠胃炎、伤口感染以及败血症等, 是人类重要的食源性病原体之一[1, 2]; 同时, 副溶血弧菌也是许多海洋养殖生物常见的病原菌, 包括鱼类、甲壳类和贝类等; 比如: 近年来该菌感染引起了凡纳滨对虾的急性肝胰腺坏死症(Acute hepatopancreas necrosis syndrome, AHPNS)在全球范围内爆发蔓延, 给对虾养殖产业造成严重经济损失[3, 4]。目前研究已发现AHPNS发生原因为副溶血弧菌携带了具有编码毒素基因pirA和pirB的质粒[5]。此外, 副溶血弧菌具有较强的多样性和环境适应性, 近期研究发现该菌在淡水养殖环境和淡水水产品中具有高水平流行传播的趋势[6, 7], 其环境适应性机制备受关注, 但是针对AHPNS副溶血弧菌(VPAHPNS)的环境适应性机制研究相对缺少。
生物膜(Biofilm)是细菌适应环境的重要机制之一, 由细菌分泌的多糖、蛋白质和胞外DNA等物质并将自身包裹于其中而形成的一种特殊三维结构性细菌群落[8]。副溶血弧菌可在海洋生物体表、非生物表面及生物肠道等介质表面上黏附并快速形成生物膜, 有助于该菌的感染和致病; 特别指出的是生物膜中的副溶血弧菌具有更强的感染能力[9], 因此, 筛选靶向抑制生物膜形成的药物, 如: 大蒜E素, 是有效防控副溶血弧菌感染的重要方向[10]。胞外多糖(Exopolysaccharides, EPS)是副溶血弧菌生物膜的主要成分, 发挥了“分子胶”的角色, 协助细菌粘附到介质表面[11]。最新研究发现, 在副溶血弧菌大染色体上存在另一套与多糖合成的基因簇, 它与费氏弧菌(Vibrio fischeri)的syp基因簇同源, 被命名为scv (syp-like locus in V. parahaemolyticus)基因簇, 在一定程度上参与副溶血弧菌生物膜形成[12]。scv基因簇共有15个基因, 分别为scvA-O; 目前对于scv基因簇中各基因的功能研究还不完善, 仅发现scvJ、scvO和scvE在副溶血弧菌生物膜形成过程中发挥正向调控作用[12], 但其他scv基因生物功能也还不清楚, 有待进一步解析。
副溶血弧菌SHY1833株是从患AHPNS对虾中分离获得的病原菌, 对感染对虾具有急性致死效应[13]。本文以副溶血弧菌SHY1833为对象, 通过基因敲除、回补并结合系列表型测试实验, 研究了scv基因簇中的基因scvL在VPAHPNS生物膜形成中负调控作用。
1. 材料与方法
1.1 菌株、质粒和培养条件
本文所使用的菌株和质粒如表 1所示。副溶血弧菌SHY1833 (由江苏省海洋水产研究所沈辉教授惠赠)其及突变株使用Luria-Bertani (LB) (广东环凯微生物科技有限公司, 中国)补加2% NaCl培养液或硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖(Thiosulfate-citrate-bile salts-sources, TCBS)琼脂培养基(广东环凯微生物科技有限公司, 中国)培养; 生物膜测定时副溶血弧菌使用心浸液肉汤培养基(Heart infusion broth, HI)(Bacto™, BD Biosciences, USA)补加0.8% NaCl培养。大肠杆菌S17-1λpir用于接合实验, 使用LB培养; 琼脂平板为培养基中添加15 g/L琼脂粉(上海生工生物工程股份有限公司, 中国)。pDM4为自杀质粒, 用于基因敲除, pBBR1MCS-1质粒用于基因回补。对大肠杆菌氯霉素使用浓度为25 μg/mL, 而对于副溶血弧菌氯霉素浓度则为5 μg/mL。
表 1 本文所使用的菌株和质粒Table 1. The strains and plasmids used in this study名称Name 特征描述Characterization 来源Source 副溶血弧菌 SHY1833 pirA+/pirB+, 2017年分离于患AHPNS对虾 [13] ΔscvL SHY1833的scvL基因敲除株 本研究 ΔscvH SHY1833的scvH基因敲除株 本研究 ΔcpsA SHY1833的cpsA基因敲除株 本研究 ΔscvL:pscvL SHY1833的scvL基因回补株 本研究 WT:pscvL SHY1833的scvL基因过表达菌株 本研究 大肠杆菌 S17-1 λpir Thi pro hsdR hsdM+ recA RP4-2-Tc::Mu-Km::Tn7λpir 接合供体菌 [14] S17:pDM4_∆scvL (A1+A2) S17-1携带pDM4_∆scvL (A1+A2)质粒 本研究 S17:pDM4_∆scvH (A1+A2) S17-1携带pDM4_∆scvH (A1+A2)质粒 本研究 S17:pDM4_∆cpsA (A1+A2) S17-1携带pDM4_∆cpsA (A1+A2)质粒 本研究 质粒 pDM4 Cmr, 含依赖π蛋白oriP6K复制子和sacBR基因的自杀质粒 [15] pBBR1MCS-1 Cmr, 广宿主表达质粒 [16] pDM4_∆scvL (A1+A2) 插入有scvL两端同源臂的pDM4自杀质粒 本研究 pDM4_∆scvH (A1+A2) 插入有scvH两端同源臂的pDM4自杀质粒 本研究 pDM4_∆cpsA (A1+A2) 插入有cpsA两端同源臂的pDM4自杀质粒 本研究 pscvL 插入有scvL的pBBR1MCS-1表达质粒 本研究 1.2 序列分析及引物设计
对副溶血弧菌SHY1833株的scv基因簇序列使用DNASTAR软件包进行开放阅读框(Open reading frame, ORF)分析及氨基酸序列分析; 利用在线工具blastp (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)将对ScvL和ScvH蛋白序列与NCBI中的非冗余蛋白数据库进行搜索比对。使用Primer Premier 6.0软件设计本研究中各基因的特异性引物, 引物信息见表 2。引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。
表 2 本文所使用的引物Table 2. The primers used in this study引物名Primer name 引物序列Primer sequence (5′—3′) 用途Purpose scvL-pDM4-F1 cgcatgcaagatctatctagaTTGTCTGACTGGCTGGAC 扩增scvL上下游侧翼序列 scvL-pDM4-R1 TGCCAGTTCATGGAACGAGCTTGCTTAC scvL-pDM4-F2 GCTCGTTCCATGAACTGGCAGATAACTCG scvL-pDM4-R2 cactagtggggcccttctagaCATTTCGCTAAGGATTGG scvL-cF ACTATGAGCGATTTACGAGA scvL敲除检测 scvL-cR ACTTTAGGCAAGGTGGTG scvH-pDM4-F1 cgcatgcaagatctatctagaTTCCTTTCGGTTGGTTCG 扩增scvH上下游侧翼序列 scvH-pDM4-R1 CGTTGTTTCGTGCTCGGGCTTTGTTGTC scvH-pDM4-F2 AGCCCGAGCACGAAACAACGTCAAAGGA scvH-pDM4-R2 cactagtggggcccttctagaCACATACCCACTGCGAAC scvH-cF ATGGCTGGACTGCTGAAT scvH敲除检测 scvH-cR ATACCCACTGCGAACTTAA cpsA-pDM4-F1 cgcatgcaagatctatctagaCTCCGCACCCAAGACTAAA 扩增cpsA上下游侧翼序列 cpsA-pDM4-R1 AAGGAAGATGCCCGACGAAGGACAAGATG cpsA-pDM4-F2 CTTCGTCGGGCATCTTCCTTACCGTGTTC cpsA-pDM4-R2 cactagtggggcccttctagaCGATAATCCACGACTAAAC cpsA-cF AAGTCATCCGTTAGACCA cpsA敲除检测 cpsA-cR CAATGCCAGATTCAGTTT scvL-pBBR-F cgcggtggcggccgctctagaAACCAAAACCGACGGGTAAAG 扩增scvL的ORF及上游1000bp序列 scvL-pBBR-R gggggatccactagttctagaTTAACTGGCGAACGTCACTTTAGG RT-cpsA-F TACCGTTTTGGCCTATTTGC qPCR分析cpsA转录 RT-cpsA-R ATTTGATCCCAGCGAGAATG RT-cpsB-F TCGTTTAGGCGGCATTTATC qPCR分析cpsB转录 RT-cpsB-R CGCTTACCGTCCAGACATTT RT-cpsC-F CCCTTACCTTGGACGAATCA qPCR分析cpsC转录 RT-cpsC-R GCTAGTGCGATGGCTTTTTC RT-cpsD-F TCGACGACATCAAAGCAGTC qPCR分析cpsD转录 RT-cpsD-R ATCGGCAGAACGAAAGCTAA RT-cpsQ-F TGGCTTGCGTCCTATTTTTC qPCR分析cpsQ转录 RT-cpsQ-R GAGGATTAGGGGCCATTGTT RT-rpoA-R TCGCCGCATTCTTCTATCTT qPCR分析rpoA转录 RT-rpoA-R TCAGCGTTGTCATCCGTTAG 1.3 缺失突变株、回补株和过表达株构建
副溶血弧菌SHY1833的缺失突变株构建参考实验室常用方法[17]。步骤大致: 使用特定引物(表 2) PCR扩增目标基因的上下游臂, 并通过重叠延伸PCR(Gene splicing by overlap extension PCR, SOE-PCR)将它们连接后克隆至自杀质粒pDM4中, 获得重组自杀质粒pDM4_∆X(A1+A2), 并分别转化到大肠杆菌S17-1 λpir菌株中。通过S17-1λpir的接合作用, 将重组自杀质粒转移到副溶血弧菌SHY1833中, 在含有5 μg/mL氯霉素的TCBS琼脂平板上筛选出携带自杀质粒的副溶血弧菌克隆。随后, 将携带重组自杀质粒的副溶血弧菌克隆经含有10%蔗糖的培养基筛选, 获得目标基因缺失的菌株。
使用特定引物(表 2)PCR扩增scvL的完整ORF及上游约1000 bp序列, 并将其克隆到pBBR1MCS-1载体中, 构建回补用重组表达载体, 通过大肠杆菌S17-1λpir接合将重组表达载体转移至缺失突变株ΔscvL中, 通过含5 μg/mL氯霉素的TCBS平板筛选获得回补株ΔscvL: pscvL。将其接合转移至SHY1833野生株中, 同样通过含5 μg/mL氯霉素的TCBS平板筛选获得过表达株WT: pscvL。
1.4 生物膜生成量检测
生物膜生成量测定参考实验室常用方法[18]。结晶紫染色步骤: 将培养过夜的SHY1833野生株及其各突变株按1%比例接种于含0.8% NaCl的HI中, 分别置于96孔板进行培养, 温度为37℃, 转速为100 r/min。在培养不同时间(6h、12h、24h、36h、48h和60h)后弃培养液, 并用PBS缓冲液(Phosphate-buffered saline, pH 7.2—7.4)轻轻漂洗各孔残留菌液。随后加入用0.1% (wt/vol)结晶紫在室温下染色30min, 弃染液后用PBS缓冲液漂洗孔壁上的残余染料, 再加入无水乙醇溶解结晶紫, 使用多功能酶标仪(Tecan Spark, Swiss)测定各孔在595 nm下的吸光值。
荧光染色过程: SHY1833野生株及其各突变株接种于含有无菌盖玻片的12孔板中, 培养基及条件同上。培养12h后, 使用PBS缓冲液漂洗盖玻片, 然后加入SYTO-9 (上海联迈生物工程有限公司, 中国) 染色20min, 使用倒置荧光显微镜(Carl Zeiss AG, Germany)观察并拍照细菌生物膜形成情况。
1.5 菌落形态观察
将SHY1833野生株及其突变株培养至OD600约0.5时, 取3 μL点斑至刚果红(Congo red, CR)琼脂平板上(HI培养基添加15 g/L琼脂粉, 含有0.04%刚果红和0.02%考马斯亮蓝), 在37℃倒置培养24h后, 显微镜下观察野生型与突变菌株菌落形态的变化。
1.6 实时荧光定量PCR分析
将SHY1833野生株及其各突变株在LB+2% NaCl培养基中培养至12h后, 取1 mL菌液在4℃ 情况下10000×g 离心1min收集菌体。使用TRIzol® (Thermo Fisher, USA)提取菌体总RNA, 操作过程严格按照说明书进行。cDNA制备按照逆转录试剂盒(TaKaRa, Japan)说明书进行。
实时荧光定量 PCR以cDNA为模板, 采用10 μL反应体系(5 μL AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix; 4 μL ddH2O; 正反引物各0.25 μL, 终浓度为 2.5 μmol/L; 0.5 μL cDNA), 在LightCycler 96荧光定量 PCR 仪(Roche, Swiss)中进行; 各多糖基因的正反引物见表 2所示, rpoA基因为内参。数据以2–ΔΔCt法进行相对定量分析。
1.7 胞外多糖测定
生物膜胞外多糖分为可溶性多糖和不可溶性多糖, 均采用苯酚硫酸法进行测定[19]。首先绘制标准曲线: 称取烘干的葡萄糖标准品1 g, 溶解于100 mL蒸馏水中, 配成10 mg/mL的标准贮备液, 吸取1 mL贮备液定容至100 mL, 配成0.1 mg/mL的葡萄糖标准液。分别吸取葡萄糖标准溶液0、200、400、600、800和1000 μL, 分别置于25 mL离心管中, 吸取蒸馏水补加至2 mL, 并加入2 mL苯酚溶液, 震荡混匀1min, 小心加入浓硫酸10 mL, 再混匀1min, 置沸水浴15min, 冷却后测定OD490的值, 绘制葡萄糖标准曲线。测定菌液中可溶性多糖: 吸取10 mL培养液至50 mL离心管中, 3000 r/min离心15min取上清液, 加入等体积无水乙醇, 混匀5min, 3000 r/min离心15min, 弃去上清, 沉淀用10 mL水溶解, 吸取2 mL按照标准曲线中的方法测定OD490, 从标准曲线中读取葡萄糖含量。测定生物被膜中不可溶性多糖: 使用250 mL锥形瓶静置培养生物膜, 24h后, 去除培养液, 将气液表面和底部的生物膜重悬, 4℃、3000 r/min下离心30min, 弃去上清, 沉淀用等量0.85%氯化钠溶液(含甲醛 0.22%)重悬, 80℃水浴加热30min, 上清按照标准曲线中的方法测定不可溶性多糖。
1.8 数据处理
实验数据以平均值±标准差(mean±SD)表示。采用 GraphPad Prism 9.5.1 软件进行统计分析和绘图。对于两组数据之间的比较, 使用双边 t 检验(Two-tailed t-test)来分析差异显著性; 对于多组数据之间的比较, 则采用单因素方差分析(One-way ANOVA)进行分析。在单因素方差分析显示组间存在显著差异的情况下, 进一步采用Duncan多重范围检验(Duncan’s Multiple Range Test)进行两两比较。P<0.05被认为具有统计学显著性。
2. 结果
2.1 scvL缺失促进副溶血弧菌SHY1833生物膜的形成
scvL开放阅读框大小为1434 bp, 编码长度为477个氨基酸残基的蛋白质ScvL; 蛋白序列同源性比对显示ScvL属于GumC家族成员, 发挥决定多糖链长度(Polysaccharide chain length determinant protein)的功能, 参与胞外多糖的转运和合成; 同时, 在该蛋白的第200至472个氨基酸区域与酪氨酸蛋白激酶(Tyrosine-protein kinase)具有较高同源性。scvH开放阅读框大小为1173 bp, 编码长度为390个氨基酸残基的蛋白质ScvH, 蛋白序列同源性比对显示ScvH为糖苷转移酶家族成员。为分析scv基因簇基因在副溶血弧菌生物膜形成中的作用, 我们构建了副溶血弧菌SHY1833分离株scv基因簇中scvL和scvH的缺失突变株ΔscvL和ΔscvH; 同时, 构建了荚膜多糖cps基因簇中cpsA的缺失突变株ΔcpsA。结晶紫染色测定生物膜形成量显示, HI培养基中培养24h时突变株ΔscvL生物膜的形成量显著高于野生株, 而突变株ΔscvH与野生株的生物膜形成量相当(图 1A); 作为对照, cpsA缺失导致副溶血弧菌的生物膜形成量明显下降(图 1A)。荧光染料染色培养12h的生物膜结果显示, 敲除scvL后, 荧光强度较野生株有显著的提高, 而敲除cpsA的菌株荧光强度与野生株相比明显降低(图 1B), 与结晶紫测定结果一致。以上说明scvL缺失促进副溶血弧菌SHY1833生物膜的形成。
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图 1 副溶血弧菌生物膜形成测定A. 结晶紫染色法定量测定培养24h的生物膜形成量; 横坐标代表不同副溶血弧菌菌株, WT为野生型菌株, Control为培养基对照, 纵坐标代表 595的吸光值; 荧光染色观察生物膜形成; B. 副溶血弧菌不同菌株在盖玻片上培养12h后用SYTO-9染色, 用40倍物镜下荧光显微镜观察; *P<0.05, n.s. 无显著差异Figure 1. Vibrio parahaemolyticus biofilm formation assayA. Crystal violet staining is used to quantitatively measure the amount of biofilm formation after 24h of culture; The horizontal axis represents different Vibrio parahaemolyticus strains, WT is the wild type strain, Con is the medium control, and the vertical axis represents the absorbance value of 595; B. Biofilm formation was observed by fluorescence staining. Different strains of Vibrio parahaemolyticus were cultured on cover slides for 12h before staining with SYTO-9 and observed under a fluorescence microscope with a 40× objective; *P<0.05, n.s. no significant difference2.2 ScvL对副溶血弧菌生物膜形成发挥负调控作用
为进一步分析ScvL对副溶血弧菌生物膜形成中发挥的作用, 在缺失突变株的基础上构建了回补株ΔscvL: pscvL, 以及在野生株基础上构建了scvL过表达菌株WT: pscvL。结晶紫染色法测定培养60h内的不同时间点生物膜形成量, 结果显示除6h外, 缺失突变株ΔscvL在其余时间点的生物膜形成量都高于野生株, 而回补后恢复到野生株水平; 相反, 在野生株中过表达scvL后明显降低了生物膜的形成量(图 2)。综合以上结果, 说明ScvL对副溶血弧菌生物膜形成发挥负调控作用。
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图 2 结晶紫染色测定不同时间点副溶血弧菌生物膜形成横坐标代表不同时间点, 纵坐标代表 595的吸光值; WT为野生型菌株, Control为培养基对照; 统计分析来源于 3 组数据, 数值用平均数表示Figure 2. Determination of biofilm formation of Vibrio parahaemolyticus at different time points by crystal violet stainingThe horizontal axis represents the absorbance value of 595 at different time points, and the vertical axis represents the absorbance value of 595; WT is the wild-type strain and Control is the medium control; The data are expressed as mean±SE from three independent experiments2.3 scvL缺失使副溶血弧菌菌落形态呈皱褶且不透明
为分析ScvL调控副溶血弧菌生物膜形成的同时, 是否影响菌落形态等表型, 将野生株和2个突变株ΔscvL和ΔcpsA同时点斑至CR琼脂平板上, 培养24h后观察菌落形态显示, 野生株菌落呈现略微褶皱且不透明, 而ΔscvL菌落呈现更明显的褶皱且不透明, ΔcpsA菌落呈现光滑半透明(图 3), 菌落形态与生物膜测定的结果保持一致, 说明scvL的缺失可能导致副溶血弧菌SHY1833株的胞外多糖增加。
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图 3 副溶血弧菌不同菌株的在CR平板上菌落形态Figure 3. Colony morphology of different strains of Vibrio parahaemolyticus on CR plates2.4 副溶血弧菌ScvL对荚膜多糖基因的转录发挥负向影响
荚膜多糖基因簇cps是副溶血弧菌生物膜形成的主要决定因子。为探讨ScvL负调控副溶血弧菌生物膜形成的机制, 利用qPCR检测了cpsA、cpsB、cpsC、cpsD和cpsQ等5个cps基因在不同菌株中的表达差异。实验结果显示, 5个cps基因在ΔscvL菌株中的转录水平都明显高于野生株, 而在过表达菌株WT: p207-scvL中则都低于野生株(图 4)。可见, ScvL对副溶血弧菌荚膜多糖基因的转录有负向调控的作用。
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图 4 副溶血弧菌cps基因簇基因的转录水平分析将不同菌株接种于含LB+2% NaCl的无菌玻璃管中, 培养12h, 检测cpsA、cpsB、cpsC、cpsD和cpsQ的表达水平; 氯霉素用于维持WT:pscvL菌株中的质粒, 内参基因为rpoA, *P<0.05Figure 4. Transcript Level Analysis of cps gene cluster genes in Vibrio parahaemolyticusDifferent strains are inoculated in sterile glass tubes containing LB+2% NaCl and cultured for 12h. The expression levels of cpsA, cpsB, cpsC, cpsD, and cpsQ are detected. Chloramphenicol is used to maintain the plasmid in the WT: pscvL strain, and the reference gene is rpoA, *P<0.052.5 ScvL缺失导致副溶血弧菌胞外不可溶性多糖的增多
细菌胞外多糖可分为可溶性胞外多糖和不可溶性胞外多糖, 其中前者是生物膜中的能量储存库, 为细菌细胞提供能量, 而后者是生物膜中的结构物质影响着生物膜的形成[20]。根据上述生物膜和菌落形态的结果, 推测ScvL可能影响了副溶血弧菌SHY1833株胞外多糖的产量。为此通过苯酚硫酸法测定了菌株中两种胞外多糖含量, 结果显示ΔscvL菌株的不可溶胞外多糖的量明显比野生株高, 而可溶胞外多糖的量却相反(图 5A), 与野生株相比有一定程度下降(图 5B), 这与预期相符。以上结果说明敲除ScvL后导致副溶血弧菌SHY1833株的荚膜多糖基因簇cps基因表达上调, 进而影响了不可溶性胞外多糖增加, 最终提高了该菌的生物膜形成能力。
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图 5 副溶血弧菌胞外多糖测定A. 不可溶胞外多糖的测定; B. 可溶性胞外多糖的测定; *P<0.05Figure 5. Vibrio parahaemolyticus exopolysaccharide assayA. Determination of insoluble exopolysaccharides; B. Determination of soluble exopolysaccharides; *P<0.053. 讨论
在自然环境中细菌存在着自由生活的浮游生长和黏附于介质表面形成生物膜的两种方式生存, 两者相比生物膜形成更有利于细菌的适应不利环境(pH和温度变化、抗生素和氧化性应激等)、定植和感染。生物膜形成是一个动态且复杂的过程, 大致可分为细菌黏附(Adherence)、聚集(Accumulation)、成熟(Maturation)和解聚(Dispersal)等不同阶段[21]。弧菌是一类海洋来源的细菌, 其中部分种类如: 副溶血弧菌、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)等是人类和海洋生物的条件致病菌, 它们具有极生和侧生鞭毛, 赋予其强大的运动能力, 使其在生物膜形成的起始黏附和聚集(微菌落形成)阶段发挥关键作用, 启动生物膜在生物和非生物表面的快速形成[22]; 尤其是作为肠道感染的病原菌, 它们在生物体感染的早期阶段在肠道黏膜表面形成的生物膜, 不仅可增强细菌对肠道中不利环境的适应性或对抗生素的耐受性, 还能通过阻碍识别或减少促炎反应使细菌逃逸宿主的免疫防御, 是被动防御的“盾牌”[23, 24]。副溶血弧菌等通过形成生物膜在肠道黏膜上定植后, 有利于致病(毒力)因子功能的发挥, 如: 副溶血弧菌的第2套III型分泌系统(Type III secretion system 2, T3SS2)分泌效应蛋白至肠道上皮细胞内, 诱发肠毒性[25]。除此之外, 研究还发现生物膜也是弧菌主动进攻的“武器”, 如: 霍乱弧菌在宿主白细胞上形成生物膜并通过高浓度的毒素杀死周围环境中的免疫细胞[26]。可见, 生物膜形成能力是病原菌有效发挥致病作用的关键因素之一。
胞外多糖是细菌生物膜结构中的主要成分。在微菌落形成阶段, 细菌被诱导合成并分泌多糖, 可进一步协助细菌黏附到介质表面, 且使细菌之间彼此黏附形成一定的空间结构, 对细菌提供保护、支持和能量[27]。比如: 霍乱弧菌的多糖胶囊使其免受外源VI型分泌系统的攻击, 有助于肠道的定植[28, 29]。副溶血弧菌生物膜中胞外多糖也是最主要的成分, 位于小染色体上的VPA1403-1412 (cpsA-J)控制着副溶血弧菌胞外多糖合成[30], 其中cpsC与cpsD编码胞外多糖输出蛋白, 是合成EPS的主要基因, 而cpsA编码一种糖苷转移酶, 催化尿苷二磷酸葡萄糖(Uridine diphosphate glucose)与十一异戊烯醇单磷酸(Undecaprenyl-phosphate)之间的磷酸转移反应[31]。因此本研究中通过敲除副溶血弧菌SHY1833株cpsA作为对照, 缺失cpsA后明显降低SHY1833菌株生物膜的形成(图 1和图 2); 而且缺失cpsA后菌落的透明度增加, 结果与预期cpsA功能一致[30, 32]。
除了cps基因簇外, 副溶血性弧菌基因组中还拥有一套与费氏弧菌syp基因簇同源的基因簇(vp1458-vp1469, vp1473-vp1476), 被命名为scv; 该scv基因簇分为两个操纵子(scvABCD和svcEFGHIJKLMNO), 也一定程度上参与副溶血弧菌的生物膜形成, 如: 当scvJ、scvO和scvE缺失后, 生物膜的生成量与野生型菌株相比明显降低; scvJ编码多糖连接酶, scvO编码糖转移酶, 而scvE编码一种与费氏弧菌sypG同源的σ54依赖性调节因子, 能够促进该scv基因簇的转录从而促进胞外多糖形成[12]。虽然scv和cps基因簇都参与副溶血弧菌成熟生物膜的形成, 但是具体功能有差异, 其中scv基因簇影响了副溶血弧菌的微菌落聚集成团, 而cps影响了副溶血弧菌相邻单个细胞的相互连接[12]。值得注意的是, 本研究以副溶血弧菌SHY1833株为对象, 发现其scv基因簇中scvL缺失造成生物膜形成量明显增加, 而且scvL缺失还导致了cps基因簇基因的上调表达, 不可溶性胞外多糖增加(图 4和图 5), 这提示ScvL可能对通过对副溶血弧菌cps基因簇基因表达发挥负调控作用, 进而影响不可溶性胞外多糖, 最终控制生物膜的形成。但是以上表型与注释的ScvL生物学功能不相符, 因为ScvL是一类决定多糖链长度的蛋白质参与胞外多糖的转运和合成; 其敲除后理论上应该影响多糖结构的完整性, 导致生物膜形成量下降。不过值得指出的是, ScvL氨基酸序列中还含有酪氨酸激酶的保守结构域(位于第200至472氨基酸之间)。酪氨酸激酶是一类利用ATP作为磷酸盐供体, 催化中特定的酪氨酸残基的磷酸化, 广泛存在于动植物和微生物中; 细菌酪氨酸激酶(Bacterial tyrosine kinases)参与细菌的多个生物学功能, 包括抗生素耐药性、DNA复制与代谢、生物膜形成和毒力等[33]。但是弧菌中有关细菌酪氨酸激酶研究报道相对较少。故此, 我们推测副溶血弧菌ScvL可能发挥细菌酪氨酸激酶活性, 对cps基因簇发挥负调控作用, 进而影响生物膜形成。前期系列报道显示cps基因簇受到了多种信号通路调控, 包括scrABC操纵子以及CpsS-CpsR-CpsQ等, 如: CpsQ (VP1446)是LuxR转录调控因子家族的一员, 它能够与胞内c-di-GMP结合, 直接激活cpsA从而启动cps基因簇的转录[34, 35]。而在转录调控因子CpsQ上游其受到群体感应(Quorum sensing)信号通路的调控, 其机制是组氨酸激酶LuxQ感知胞外群体感应信号分子, 随后通过级联磷酸信号传递分别至LuxU和LuxO, 磷酸化的LuxO进而调控CpsQ的转录[12]。因此, 有关scvL如何调控cps基因簇基因表达的机制需要进一步的深入研究。总之, 本研究以副溶血弧菌SHY1833株为研究对象, 发现了其scv基因簇中的scvL具有负向调控cps基因簇的功能, 进而影响了该菌的生物膜形成和菌落形态, 为揭示scv基因簇在生物膜形成中的作用机制提供了基础, 也为开发基于靶向抑制生物膜形成的抗菌药物提供了新靶点。
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图 1 副溶血弧菌生物膜形成测定
A. 结晶紫染色法定量测定培养24h的生物膜形成量; 横坐标代表不同副溶血弧菌菌株, WT为野生型菌株, Control为培养基对照, 纵坐标代表 595的吸光值; 荧光染色观察生物膜形成; B. 副溶血弧菌不同菌株在盖玻片上培养12h后用SYTO-9染色, 用40倍物镜下荧光显微镜观察; *P<0.05, n.s. 无显著差异
Figure 1. Vibrio parahaemolyticus biofilm formation assay
A. Crystal violet staining is used to quantitatively measure the amount of biofilm formation after 24h of culture; The horizontal axis represents different Vibrio parahaemolyticus strains, WT is the wild type strain, Con is the medium control, and the vertical axis represents the absorbance value of 595; B. Biofilm formation was observed by fluorescence staining. Different strains of Vibrio parahaemolyticus were cultured on cover slides for 12h before staining with SYTO-9 and observed under a fluorescence microscope with a 40× objective; *P<0.05, n.s. no significant difference
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图 2 结晶紫染色测定不同时间点副溶血弧菌生物膜形成
横坐标代表不同时间点, 纵坐标代表 595的吸光值; WT为野生型菌株, Control为培养基对照; 统计分析来源于 3 组数据, 数值用平均数表示
Figure 2. Determination of biofilm formation of Vibrio parahaemolyticus at different time points by crystal violet staining
The horizontal axis represents the absorbance value of 595 at different time points, and the vertical axis represents the absorbance value of 595; WT is the wild-type strain and Control is the medium control; The data are expressed as mean±SE from three independent experiments
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图 3 副溶血弧菌不同菌株的在CR平板上菌落形态
Figure 3. Colony morphology of different strains of Vibrio parahaemolyticus on CR plates
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图 4 副溶血弧菌cps基因簇基因的转录水平分析
将不同菌株接种于含LB+2% NaCl的无菌玻璃管中, 培养12h, 检测cpsA、cpsB、cpsC、cpsD和cpsQ的表达水平; 氯霉素用于维持WT:pscvL菌株中的质粒, 内参基因为rpoA, *P<0.05
Figure 4. Transcript Level Analysis of cps gene cluster genes in Vibrio parahaemolyticus
Different strains are inoculated in sterile glass tubes containing LB+2% NaCl and cultured for 12h. The expression levels of cpsA, cpsB, cpsC, cpsD, and cpsQ are detected. Chloramphenicol is used to maintain the plasmid in the WT: pscvL strain, and the reference gene is rpoA, *P<0.05
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图 5 副溶血弧菌胞外多糖测定
A. 不可溶胞外多糖的测定; B. 可溶性胞外多糖的测定; *P<0.05
Figure 5. Vibrio parahaemolyticus exopolysaccharide assay
A. Determination of insoluble exopolysaccharides; B. Determination of soluble exopolysaccharides; *P<0.05
表 1 本文所使用的菌株和质粒
Table 1 The strains and plasmids used in this study
名称Name 特征描述Characterization 来源Source 副溶血弧菌 SHY1833 pirA+/pirB+, 2017年分离于患AHPNS对虾 [13] ΔscvL SHY1833的scvL基因敲除株 本研究 ΔscvH SHY1833的scvH基因敲除株 本研究 ΔcpsA SHY1833的cpsA基因敲除株 本研究 ΔscvL:pscvL SHY1833的scvL基因回补株 本研究 WT:pscvL SHY1833的scvL基因过表达菌株 本研究 大肠杆菌 S17-1 λpir Thi pro hsdR hsdM+ recA RP4-2-Tc::Mu-Km::Tn7λpir 接合供体菌 [14] S17:pDM4_∆scvL (A1+A2) S17-1携带pDM4_∆scvL (A1+A2)质粒 本研究 S17:pDM4_∆scvH (A1+A2) S17-1携带pDM4_∆scvH (A1+A2)质粒 本研究 S17:pDM4_∆cpsA (A1+A2) S17-1携带pDM4_∆cpsA (A1+A2)质粒 本研究 质粒 pDM4 Cmr, 含依赖π蛋白oriP6K复制子和sacBR基因的自杀质粒 [15] pBBR1MCS-1 Cmr, 广宿主表达质粒 [16] pDM4_∆scvL (A1+A2) 插入有scvL两端同源臂的pDM4自杀质粒 本研究 pDM4_∆scvH (A1+A2) 插入有scvH两端同源臂的pDM4自杀质粒 本研究 pDM4_∆cpsA (A1+A2) 插入有cpsA两端同源臂的pDM4自杀质粒 本研究 pscvL 插入有scvL的pBBR1MCS-1表达质粒 本研究 
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表 2 本文所使用的引物
Table 2 The primers used in this study
引物名Primer name 引物序列Primer sequence (5′—3′) 用途Purpose scvL-pDM4-F1 cgcatgcaagatctatctagaTTGTCTGACTGGCTGGAC 扩增scvL上下游侧翼序列 scvL-pDM4-R1 TGCCAGTTCATGGAACGAGCTTGCTTAC scvL-pDM4-F2 GCTCGTTCCATGAACTGGCAGATAACTCG scvL-pDM4-R2 cactagtggggcccttctagaCATTTCGCTAAGGATTGG scvL-cF ACTATGAGCGATTTACGAGA scvL敲除检测 scvL-cR ACTTTAGGCAAGGTGGTG scvH-pDM4-F1 cgcatgcaagatctatctagaTTCCTTTCGGTTGGTTCG 扩增scvH上下游侧翼序列 scvH-pDM4-R1 CGTTGTTTCGTGCTCGGGCTTTGTTGTC scvH-pDM4-F2 AGCCCGAGCACGAAACAACGTCAAAGGA scvH-pDM4-R2 cactagtggggcccttctagaCACATACCCACTGCGAAC scvH-cF ATGGCTGGACTGCTGAAT scvH敲除检测 scvH-cR ATACCCACTGCGAACTTAA cpsA-pDM4-F1 cgcatgcaagatctatctagaCTCCGCACCCAAGACTAAA 扩增cpsA上下游侧翼序列 cpsA-pDM4-R1 AAGGAAGATGCCCGACGAAGGACAAGATG cpsA-pDM4-F2 CTTCGTCGGGCATCTTCCTTACCGTGTTC cpsA-pDM4-R2 cactagtggggcccttctagaCGATAATCCACGACTAAAC cpsA-cF AAGTCATCCGTTAGACCA cpsA敲除检测 cpsA-cR CAATGCCAGATTCAGTTT scvL-pBBR-F cgcggtggcggccgctctagaAACCAAAACCGACGGGTAAAG 扩增scvL的ORF及上游1000bp序列 scvL-pBBR-R gggggatccactagttctagaTTAACTGGCGAACGTCACTTTAGG RT-cpsA-F TACCGTTTTGGCCTATTTGC qPCR分析cpsA转录 RT-cpsA-R ATTTGATCCCAGCGAGAATG RT-cpsB-F TCGTTTAGGCGGCATTTATC qPCR分析cpsB转录 RT-cpsB-R CGCTTACCGTCCAGACATTT RT-cpsC-F CCCTTACCTTGGACGAATCA qPCR分析cpsC转录 RT-cpsC-R GCTAGTGCGATGGCTTTTTC RT-cpsD-F TCGACGACATCAAAGCAGTC qPCR分析cpsD转录 RT-cpsD-R ATCGGCAGAACGAAAGCTAA RT-cpsQ-F TGGCTTGCGTCCTATTTTTC qPCR分析cpsQ转录 RT-cpsQ-R GAGGATTAGGGGCCATTGTT RT-rpoA-R TCGCCGCATTCTTCTATCTT qPCR分析rpoA转录 RT-rpoA-R TCAGCGTTGTCATCCGTTAG
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