日本鳗鲡(Anguilla japonica)为降海产卵洄游(Catadromous)鱼类, 其产卵场位于西马里亚纳海脊南部^{[1, 2]}。新孵化的仔鱼发育为柳叶型仔鳗, 被称为柳叶鳗(Leptocephalus), 其侧扁的体形随着北赤道洋流(North Equatorial Current)和黑潮暖流(Kuroshio Current)向中国、日本、韩国等大陆架漂送。柳叶鳗经过数月漂流后, 抵达大陆架或沿岸水域, 即变态为流线型的玻璃鳗(Glass eel)。当玻璃鳗身上出现色素沉着后称为线鳗(Elver)^[3]。在溯河至河川或是滞留在河口水域中成长的期间称为黄体鳗(Yellow eel)。经过数年的成长后, 变态成为银色鳗(Silver eel), 并开始进行降海繁殖洄游, 最终完成生活史^[4]。鳗鱼由黄体鳗变态为银色鳗的过程, 称为银化(Silvering)^[5]。

日本鳗鲡是亚洲重要养殖鱼种之一, 但因人工繁殖尚未完全成功^[6], 养殖所需鳗苗全靠天然捕捞, 弄清产卵群体的生物学特征及银化的生理条件被认为是人工育苗的重要前提之一^[7—10]。在人工繁殖方面, Ijiri等^[11]的研究表明银色鳗时期的人工催产效果远高于黄体鳗时期, Liao等^[13]也得到类似的研究结果, 显示银色鳗的生理与内分泌状态与黄体鳗有显著差异^[12]。长江口是我国鳗苗的主产区和目前仅存的成鳗渔业水域, 每年秋季有专业渔民捕捞降海洄游途中的成鳗。近年来, 我国学者对日本鳗鲡的研究主要集中在鳗苗的资源动态^[14—16]、分子生物学^[17—19]和生活史特征^[20—24]等研究方面, 有关成鳗银化过程中生物学及其特征的研究目前尚未见任何报道。本文以长江河口生殖洄游途中的日本鳗鲡为研究材料, 对繁殖群体银化过程中体色、年龄、全长、体重及银化指标等特征作了分析, 建立简单可靠的识别标准, 为人工繁殖的种鳗选取和质量评估提供依据。

1.   材料与方法

1.1   样品采集

2017年10月14日, 在长江河口上端的江苏靖江段(31°30′N, 120°42′E), 随捕鳗船“苏靖渔11451”采集降海洄游途中的日本鳗鲡成鱼106尾。捕捞网具为当地典型的捕鳗张网, 网口宽10—11 m, 高4.5 m, 整个网长25—30 m, 网目由网口的3 cm×3 cm逐渐缩小至网底的1 cm×1 cm。每船携带两部张网固定在船身中部, 作业时同时下网。采集位置为长江靖江段北岸离岸约2 km、水深8 m以上的水域, 张网底纲放在水下4.5 m处, 上纲与水面持平。

1.2   实验方法

标本活体带回实验室后, 用MS-222鱼用麻醉剂麻醉, 仔细观测并详细记录每尾样本头部、躯干部及胸鳍的颜色, 依据Han等^[9]和Okamura等^[7]对日本鳗鲡银化过程中各发育期体色特征描述和评判标准(表 1), 鉴定每尾标本所处的发育期。

表  1  日本鳗鲡银化过程中各期的体色特征

Table  1.  Characteristics in external appearance among three silve-ring stages of the Japanese eel collected in the Yangtze River estuary

区域Body portion	特征Characteristic	阶段Stage
		黄鳗期Yellow stage	银化前期Pre-silver stage	银化期Silver stage
头部Head	头部背侧皮肤呈现深绿色或者深灰色	+	+	−
	头部背侧皮肤呈黑色	−	+	+
	头部腹侧皮肤呈黄色或者白色, 不具有金属光泽	+	−	−
	头部腹侧皮肤呈黄色或者白色, 具金属光泽	−	+	+
	下颌前端变黑	−	+	+
	头部侧线孔清晰可见	−	+	+
胸鳍Pectoral fins	胸鳍基部出现金属斑	−	+	+
	金属斑扩大到胸鳍中部	−	+	+
	胸鳍部分黑化, 外缘仍呈半透明	+	+	+
	胸鳍全部黑化, 外缘亦完全黑化	−	−	+
躯干部Trunk	背侧皮肤呈深绿色或者深灰色	+	+	−
	背侧皮肤呈黑色	−	+	+
	腹部具有银色金属光泽	−	+	+
	体侧皮肤逐步变黑, 黑色素沉着至胸鳍上缘	−	+	+
	体侧皮肤逐步变黑, 黑色素沉着至胸鳍下缘	−	−	+
注: +部分或全部个体出现此特征; −全部个体均不出现此特征Note: Plus sign (+) indicates that each characteristic was observed those in part or all of the specimens, while minus sign (−) indicates those was not observed in any specimens of each stage

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随后, 用钢卷尺测量全长(Total length, TL)(精确至1 mm), 用电子天平称量体重(Body weight, BW)(精确至1 g)。由于同一尾鳗鲡眼径和胸鳍长在左、右体侧均无显著差异^[25], 因此用游标卡尺统一测量标本左胸鳍长(Pectral fin length, L_p)、左眼的垂直眼径(Horizontal eye diameter, A)和水平眼径(Vertical eye diameter, B), 均精确至0.1 mm。解剖并根据雌、雄个体性腺的解剖学特征: 卵巢呈皱缩状长飘带形、精巢以有“叶状器官”为依据, 确定其性别^[26]。采用分析天平称量性腺(Gonad weight, GW)和消化道(Digestive tract weight, DW, 消化道包括胃和肠)重量, 均精确至0.01 g。基于上述测量参数, 依据公式计算下列5项银化指标^{[25, 27]}, 包括: (1)丰满度(Condition factor, CF), CF=BW(g)/TL(cm)³×1000; (2)性腺指数(Gonad-somatic index, GSI), GSI=GW(g)/BW(g)×100; (3)消化道指数(Digestive tract index, DTI), DTI=DW(g)/BW(g)×100; (4)胸鳍指数(Pectoral fin index, PI), PI=L_p(mm)/TL(mm)×100; (5)眼径指数(Eye index, EI), EI={[(A+B)/4]²×π/TL(mm)}×100

最后, 挖取矢耳石作为年龄鉴定材料, 依据谢正丽等的日本鳗鲡耳石制备、年轮确认和计数方法^[28], 制备耳石磨片并鉴定每尾样本的年龄。

1.3   数据分析

采用Kruskal-Wallis分析样本年龄、全长、体重和银化指标(丰满度、性腺指数、消化道指数、胸鳍指数和眼径指数)在雌性、雄性间及各发育期的差异性。对雌性和雄性不同发育期的银化指标(丰满度、性腺指数、消化道指数、胸鳍指数和眼径指数)分别进行主成分分析和判别分析。数据处理和分析、图形绘制用EXCEL 2007、SPSS 16.0和R 3.33软件进行。

2.   结果

2.1   性别、发育期及体色特征

采集到的106尾日本鳗鲡样本中, 有雌鳗74尾, 雄鳗32尾。根据银化过程的体色特征鉴定, 这些样本包括银化前期(Pre-silver stage, S0)和银化期(Silver stage, S1)二个发育期, 分别占个体总数的58.5%和41.5%, 未见黄鳗期(Yellow stage, Y)个体。雌性个体中, S0期和S1期分别占52.7%和47.3%; 雄性个体中, S0期和S1期分别占全部个体数的71.9%和28.1%。同一银化时期, 体色发育特征在雌、雄个体间并无明显区别。具体表述如下:

银化前期S0(n=62): 仅11.3%样本背侧皮肤仍呈深绿色或深灰色(n=7), 88.7%样本背侧皮肤已黑化为黑色(n=55); 100%样本下颌前端黑化(n=62), 93.5%样本头部侧线孔清晰可见(n=58); 100%样本腹部具有银色金属光泽, 同时体侧皮肤逐步变黑, 但黑色素沉着仅达胸鳍上缘(n=62) (图 1); 全部个体的胸鳍基部均已出现金属斑(图 2a), 有46.8%个体金属斑扩大至胸鳍中间(n=29) (图 2b); 100%个体胸鳍部分黑化, 但胸鳍外缘仍呈半透明(n=62) (图 2a、2b)。

图  2  日本鳗鲡银化过程中胸鳍颜色的变化特征

(a), (b) 银化前期; (c) 银化期。示意图中△表示金属斑; —表示黑化区域

Figure  2.  Characteristics of the pectoral fin colorations in the silvering process of the Japanese eel Anguilla japonica collected in the Yangtze River estuary

(a), (b)Pre-silver stage; (c) Silver stage. The schematic illustrations show the distribution patterns of metallic hue (triangles) and the melanization patterns (black lines) on the fins

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银化期S1 (n=44): 100%样本背侧皮肤已黑化为黑色或深黑色, 下颌前端黑化且头部侧线孔均清晰可(n=44); 同时, 腹部均具有明显银色金属光泽, 体侧皮肤黑化加剧, 黑色素沉着蔓延至胸鳍下缘(n=44) (图 1); 全部个体的胸鳍基部均已出现金属斑, 其中84.1%样本胸鳍金属斑扩大到胸鳍中间(n=37); 但仅13.6%样本胸鳍全部黑化, 即外缘亦完全黑化(n=6, 图 2c), 86.4%样本胸鳍外缘仍呈半透明(n=38)。

图  1  日本鳗鲡银化前期和银化期的体色特征

S0.银化前期; S1. 银化期

Figure  1.  Body color characteristics of the Japanese eel in the two stages collected in the Yangtze River estuary

S0. Pre-silver stage; S1. Silver stage

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2.2   年龄

经鉴定, 雌鳗包括3—9龄7个年龄组, S0期群体(3—7龄)的平均年龄显著小于S1期群体(3—9龄) (P<0.05); 而雄鳗包括3—6龄4个年龄组, 平均年龄在S0期(3—6龄)和S1期(4—6龄)间无显著性差异(P>0.05) (图 3)。

图  3  日本鳗鲡银化前期和银化期的年龄组成

S0. 银化前期; S1. 银化期

Figure  3.  Frequency distributions of the age in the two stages of the Japanese eel collected in the Yangtze River estuary

S0. Pre-silver stage; S1. Silver stage

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2.3   银化指标比较

全长、体重和丰满度　　Kruskal-Wallis分析显示, 雌鳗的全长、体重和丰满度(TL: 52.7—88.0 cm, BW: 240—1360 g和CF:1.44—2.54)均显著大于雄鳗(TL: 44.6—64.1 cm, BW: 140—450 g和CF: 1.27—1.82) (P<0.05)。在雌鳗群体中, 全长在S0期(TL: 54.1—81.9 cm)和S1期(TL: 52.7—88.0 cm)无显著差异(P>0.05), 但体重和丰满度在S0期(BW: 260—930 g, CF: 1.44—2.25)均显著小于S1期群体(BW: 240—1360 g, CF: 1.59—2.54) (P<0.05); 而雄鳗群体中, 全长、体重和丰满度在S0期(TL: 44.6—62.3 cm, BW: 140—360 g, CF:1.27—1.82)和S1期(TL: 53.0—64.1 cm, BW: 210—450 g, CF: 1.36—1.80)均无显著差异(P>0.05) (图 4)。

图  4  日本鳗鲡银化前期和银化期的全长、体重和丰满度分布

S0. 银化前期; S1. 银化期

Figure  4.  Frequency distributions of the TL, BW and condition factor in the two stages of the Japanese eel collected in the Yangtze River estuary

S0. Pre-Silver Stage; S1. Silver stage

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眼径指数和胸鳍指数 　　比较可见(图 5), 雌鳗(EI: 3.2—6.8)的眼径指数显著大于雄鳗的(EI: 2.7—6.3) (P<0.05), 而胸鳍指数在雌、雄群体间无显著差异(P>0.05)。在雌鳗群体中, S0期(PI: 3.1—5.9, EI: 3.2—5.4)的胸鳍指数和眼径指数均显著小于S1期(PI: 4.1—6.3, EI: 5.0—6.8) (P<0.05); 而雄鳗群体中, S0期(EI: 2.7—5.0)的眼径指数亦显著小于S1期(EI: 5.0—6.3) (P>0.05), 但胸鳍指数在S0期(PI: 3.9—6.2)和S1期(PI: 4.6—6.2)间无显著差异(P>0.05)。值得注意的是, 无论雌、雄群体, S1期样本的眼径指数均≥5, 而除5尾S0期的雌鳗外, 91.8%的S0期样本眼径指数均小于5 (图 5)。

图  5  日本鳗鲡银化前期和银化期的眼经指数和胸鳍指数分布

S0. 银化前期; S1. 银化期

Figure  5.  Frequency distributions of the eye index and pectoral index in the two stages of the Japanese eel collected in the Yangtze River estuary

S0. Pre-silver stage; S1. Silver stage

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性腺指数和消化道指数　　Kruskal-Wallis分析显示, 雌鳗群体(GSI: 0.11—2.11)的性腺指数显著大于雄鳗(GSI: 0.11—0.48) (P<0.05), 但消化道指数在雌、雄群体间无显著差异(P>0.05)。在雌鳗群体中, S0期(GSI: 0.11—1.86)的性腺指数显著小于S1期(GSI: 1.00—2.11) (P<0.05), 但消化道指数变化则相反, 为S0期(DTI: 0.47—2.31)显著大于S1期(PI: 0.41—1.74) (P<0.05)。同样在雄鳗群体中, S0期(GSI: 0.11—0.37)的性腺指数显著小于S1期(GSI: 0.21—0.48) (P<0.05), S0期(DTI: 0.50—2.76)的消化道指数略大于S1期(DTI: 0.40—1.82), 但差异未达显著水平(P>0.05) (图 6)。

图  6  日本鳗鲡银化前期和银化期的性腺指数和消化道指数分布

S0.银化前期; S1. 银化期

Figure  6.  Frequency distributions of the GSI and digestive tract index in the two stages of the Japanese eel collected in the Yangtze River estuary

S0. Pre-silver stage; S1. Silver stage

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2.4   主成分分析和判别分析

雌鳗银化指标的主成分及判别分析　　对74尾雌鳗中的5个银化指标(PI、EI、GSI、CF和DTI)作主成分分析, 结果显示前3个主成分的累计贡献率达76.0%。由主成分双序图可见, 97.4%的S1期个体位于左侧区域, 表现为较高的丰满度、较大的眼径和较长的胸鳍、以及较高的性腺指数和较低的消化道指数。94.3%的S0期个体位于右侧区域, 表现恰好相反, 即较低的丰满度、较小的眼径和较短的胸鳍, 以及较低的性腺指数和较高的消化道指数(图 7a)。

图  7  基于银化指标的日本鳗鲡主成分分析双序图

▲S0.银化前期; □S1.银化期

Figure  7.  PCA biplots of females (a) and males (b) the Japanese eel collected in the Yangtze River estuary carried out on the silvering index

Dark triangles and gray squares represent pre-silver stage and silver stage individuals, respectively

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利用逐步判别分析法, 根据变量对模型的贡献大小, 逐步剔除不相关变量, 最终筛选出4个变量, 即胸鳍指数值PI、性腺指数GSI、眼径指数EI和丰满度CF。所建立的判别方程为:

S0期: F₁=19.71×PI+45.15×GSI+25.30×EI+59.14×CF–184.14

S1期: F₂=21.80×PI+51.37×GSI+30.82×EI+65.40×CF–242.00

将每尾雌性个体的4个变量代入上述2个判别方程, 分别计算F₁和F₂, 若F₁>F₂, 则该个体为S0期, 否则为S1期。判别发现, 74尾个体仅2尾被错判, 初始判别正确率高达97.3%。其中, 39尾S0期个体中有2尾误判为S1期, 正确率为94.9%; 35尾S1期群体全部判别为S1期, 正确率为100%。交互验证结果与初始判别结果类似, S0期84.6%, S1期为100%, 总正确率为91.7% (表 2)。

表  2  基于银化指标的日本鳗鲡银化时期判别分析和交互检验结果

Table  2.  The membership of the two stages predicted by the canonical discriminant analysis for the two stages classified by the silvering index

性别Sex	判别分析Discriminant analysis		银化时期Stage		总计Total	正确率Accuracy (%)
			银化前期S0	银化期S1
雌Female	初始判别Original result	S0	37	2	39	94.9
		S1	0	35	35	100.0
	交互检验Cross-validation result	S0	33	6	39	84.6
		S1	0	35	35	100.0
雄Male	初始判别Original result	S0	22	1	23	95.7
		S1	0	9	9	100.0
	交互检验Cross-validation result	S0	22	1	23	95.7
		S1	1	8	9	88.9

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雄鳗银化指标的主成分及判别分析　　同样, 对32尾雄鳗中的5个银化指标(PI、EI、GSI、CF和DTI)进行主成分分析和判别分析。主成分分析结果显示, 前3个主成分累计贡献率为74.6%。由主成分双序图可见, 100%S1期个体位于左侧区域, 表现为较大的眼径和较高的性腺指数, 以及较低的消化道指数; 82.6%的S0期个体位于右侧区域, 表现为较小的眼径和较小性腺指数, 以及较高的消化道指数。但S1和S0期在胸鳍指数和丰满度值分布上区分不明显(图 7b)。

利用逐步判别分析法, 最终筛选出2个变量, 即性腺指数GSI和眼径指数EI。雄鳗所建立的判别方程为:

S0期: M₁=52.32×GSI+13.25×EI–33.71

S1期: M₂=73.26×GSI+17.79×EI–61.09

从判别结果可知, 在32尾个体中仅有1尾被错判, 初始判别正确率高达96.9%。其中, 23尾S0期个体中有1尾误判为S1期, 正确率为95.7%; 9尾S1期群体全部判别为S1期, 正确率为100%。交互验证结果与初始判别结果类似, S0期95.7%, S1期为88.9%, 总正确率为93.8% (表 2)。

3.   讨论

3.1   日本鳗鲡银化过程的分期及体色判别特征

黄体鳗变态为银色鳗(即银化过程)是一个缓慢的渐变过程^{[3, 29]}。背部与胸鳍随着黑色素(Melanosomes)的增多而变为深黑色, 腹部因嘌呤(Purines)的沉积而银化为银白色^[30], 这一“反荫蔽色(Countershading coloration)”的出现被认为是黄体鳗变态成为银色鳗的体色判别标准, 从而将银化过程分为黄鳗期和银化期2个阶段^[3]。近年来, Han等^[9]和Okamura等^[7]分别依据中国台湾和日本的标本, 发现除黄鳗期和银化期外, 还存在一个中间阶段, 表现为“形态上已初步具有部分银化特征, 如背部和胸鳍开始黑化、胸鳍基部出现金属斑、腹部逐渐出现银色等, 但性腺指数等银化指标仍处于低值”。但对中间阶段的归属存在分歧: Okamura等^[7]认为中间阶段的银化指标(特别是GSI和DTI)较银化期差异较大, 仍隶属黄鳗阶段, 归为黄鳗晚期(Late-yellow stage); 而Han等^[9]认为中间阶段已开始了银化过程, 且GSI显著高于黄鳗期, 应隶属银色鳗阶段, 归为银化前期。本研究的样本均采自长江口降海生殖洄游途中, 普遍认为, 启动降海洄游即意味着银化过程起始^[3]。因此我们将中间类型的样本均归属于银化前期, 这同样也是本研究未见黄鳗期样本的原因。

体色观测结果显示, 长江口日本鳗鲡银化过程(从S0期至S1期)的体色变化为“反荫蔽色”形成并逐步完善的过程, 具体表现为背侧皮肤由深绿色或者深灰色逐渐变为深黑色、胸鳍由部分黑化逐步变为完全黑化、胸鳍基部的金属斑由基本向上扩大至中间、体侧黑色素沉积从胸鳍上缘蔓延至胸鳍下缘的过程。Pankhurst等^[30]认为, 反荫蔽色的形成有利于降海生殖洄游途中的伪装, 是鳗鲡生殖过程所必须的。

已有研究表明, 由于环境条件和个体的生理差异, 不同水体日本鳗鲡银化体色变化进程会有所差异, 因而体色判别标准也可能会有所调整^{[3, 7, 8]}。Okamura等^[7]发现, 日本三湾河的日本鳗鲡各发育期之间在头部和躯干部体色性状有所重叠, 但可依据“胸鳍外缘是否黑化”这个标准来区分个体是处于银化前期, 还是银化期。本研究发现, 银化期样本中仅有13.6%的个体胸鳍外缘完全黑化, 但100%个体的体侧黑色素沉着已蔓延至胸鳍下缘, 而银化前期样本的体侧黑色素沉着仅达胸鳍上缘。因此, 本文建议采用“体侧黑色素是否蔓延至胸鳍下缘”作为判别长江口日本鳗鲡银化前期和银化期的体色标准。

3.2   长江口日本鳗鲡的银化指标及度量判别特征

由于内分泌机制的驱使, 在体色银化的同时亦伴随着形态和生理的变化^[8]。度量指标研究显示, 银化过程中, 体型、胸鳍长、眼径、性腺指数总体呈递增趋势, 消化道指数呈递减趋势。基于银化指标的主成分分析亦表明, 虽有少量交叉或重叠, 但总体上银化前期和银化期的区分特征明显: 银化前期丰满度较低、眼睛小、胸鳍较短, 具有相对较低的性腺指数和较高的消化道指数; 银化期丰满度较高、眼睛大、胸鳍较长, 具有较高的性腺指数和较低的消化道指数。由于日本鳗鲡的产卵场位于3000 km之遥的马里亚纳海沟^[1], 胸鳍的增大可能是为增进游泳能力。眼径的增大及视网膜中视锥细胞逐渐被视杆细胞取代^{[10, 27]}, 可能有助于适应深海弱光环境。由于日本鳗鲡在繁殖洄游过程中并不摄食, 消化道的萎缩有助于减轻体重, 减少能量消耗, 这些形态的修正均可能是为了适应即将起始的长距离迁徙。

已有研究发现, “眼径指数”可作为鳗鲡银化期野外快速识别的依据。欧洲鳗鲡(A. anguilla)这一判别值为EI>6.5^[27]; 澳洲鳗鲡(A. australis)和大鳗鲡(A. dieffenbachii)的判别值分别为EI>4.5和>6.6^[31]; Okamura等^[7]依据日本三湾河的样本, 建议日本鳗鲡的判别值为EI>5。本研究显示, 100%的银化期样本EI≥5, 91.8%的银化前期样本EI<5(图 5), 因此长江口日本鳗鲡群体亦可采用EI>5作为银化期的判别值。近年来, 基于银化指标的多元判别分析被应用于欧洲鳗鲡^[5]、美洲鳗鲡(A. rostrata)^[32]和日本鳗鲡^[7]的发育期识别, 并取得较好地识别效果。本研究筛选出的银化指标所建立的判别方程, 对日本鳗鲡雌、雄群体的银化前期和银化期的判别分析, 均取得了95%以上的成功率, 具有一定的应用价值。

3.3   长江口日本鳗鲡雌雄群体的银化年龄和全长

本研究还显示, 银化期雌鳗群体的平均全长和年龄分别为(68.4±6.5) cm和5.4a, 而雄鳗则仅为(55.9±3.7) cm和4.8a, 雄鳗明显小于雌鳗(图 3、图 4)。这一现象在珠江[雌鳗: (61.4±4.1) cm和8.3a, 雄鳗: (48.3±4.5) cm和6.4a]和台湾[雌鳗: (63.1±1.5) cm和6.7a; 雄鳗:(54.8±1.8) cm和5.9a]水体的日本鳗鲡研究中也有报道^{[4, 8]}。日本鳗鲡为一次产卵类型, 即属于非重复产卵类型(Semelparous)鱼类^[33], 为了增加子代的产出量, 雌型采用了体型最大化(Size maximum)策略以保证更多的怀卵量, 而雄性则采用了小体型的时间最小化策略(Time-minizing)^[34], 雌、雄生长策略的不同可能是造成雌、雄群体银化期全长和年龄差异的原因。比较亦可见, 长江口日本鳗鲡群体的银化年龄略低于台湾和珠江群体, 但平均全长却相对较高, 可能的推测是长江的环境可能更适合于日本鳗鲡的肥育和性腺成熟。