Smad家族蛋白是细胞内重要信号转导蛋白, 直接参与转化生长因子-β (Transforming growth factor-β, TGF-β)超家族中成员如TGF-β、骨形成蛋白(Bone morphogenetic proteins, BMPs)、生长分化因子(Growth differentiation factor, GDF)、激活素(Activins)等多个信号的转导, 进而参与多种细胞的增殖、分化、迁移及凋亡等过程^[1]。Smad家族蛋白主要负责将细胞膜上TGF-β信号从细胞外传递到细胞核内, 调控核内靶基因转录^[2]。Smad蛋白最初从果蝇(Drosophila melanogaster)^{[3, 4]}中发现, 目前在哺乳动物中已发现至少有8个成员, 即Smad1-8^[5]。Smad1、Smad5蛋白主要被BMP/GDF受体磷酸化, 参与BMP/GDF信号通路的传导^[6]。目前, 有关Smad1、Smad5的功能研究已经很多, 如人(Homo sapiens)^[7]、小鼠(Mus musculus)^[8]、家兔(Oryctolagus cuniculus)^[9]等, 诱导软骨和骨的形成及骨的修复, 在胚胎发育中中胚层的形成和发育、各种其他器官系统的发育和成型方面是必需的。关于Smad1和Smad5基因在软体动物的研究较少, 现有的研究表明: 贝类Smad1/5蛋白为高等动物Smad1和Smad5的同源蛋白, 具有脊椎动物Smad1和Smad5蛋白类似的功能^{[10, 11]}; 如Liu等^[10]发现Smad1/5基因参与太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)的背部化、胚层分层、贝壳发生等早期胚胎发育过程; 钱雪骏等^[11]发现Smad1/5基因与泥蚶(Tegillarca granosa)的肌肉生长和幼虫变态发育有关; 郭慧慧^[12]对栉孔扇贝(Chlamys farreri)Smad家族基因的研究中发现了一个同源基因Smad1, 参与成体肌肉的生长过程及幼虫发育、变态过程。

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms, SNP)是指在生物的基因组水平上, 由于单个核苷酸碱基发生变异引起DNA序列产生的多态性^[13]。SNPs标记主要通过与经济性状紧密连锁的标记对经济性状进行分子标记辅助选择, 能够有效对复合性状进行改良, 作为克服生长性状衰退的有效方法之一^[14]。文蛤(Meretrix meretrix)是我国沿海重要经济滩涂贝类之一, 开展文蛤生长相关功能基因的分子标记研究, 对其基因资源的挖掘利用和分子辅助选择育种具有重要意义。目前有关其功能基因与生长性状相关的SNP位点的研究已有一些报道, 在长链酯酰辅酶A合成酶(ACSL1)^[15]、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK10)^[15]、果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(FBA)^[16]、生长因子受体结合蛋白2(GRB2)^[17]、转硫酶样基因(SULT)^[18]、组蛋白去乙酰化酶1 (HDAC1)^[19]等基因中筛查出与生长相关的SNPs位点, 而文蛤Smad1/5(Mm-Smad1/5)基因相关研究尚未见报道。本研究利用RACE技术克隆获得Mm-Smad1/5基因的cDNA全长序列, 利用qRT-PCR技术对不同组织和发育时期表达差异分析, 初步探讨其在文蛤生长发育过程中调控作用, 也为研究Smad1/5基因在其它贝类生长、发育过程中的调控作用提供参考; 采用直接测序法筛查了Mm-Smad1/5基因外显子区域SNP位点, 并进行其与生长相关性分析, 为文蛤生长性状相关标记的开发和分子标记辅助育种提供基础资料。

1.   材料与方法

1.1   实验材料

实验用文蛤取自浙江省宁波甬盛水产种业有限公司, 随机取4颗文蛤, 分别取闭壳肌、水管、外套膜、斧足、鳃、内脏团6个组织样品, 液氮速冻后, –80℃冻存备用。于2014年7—8月, 选取贝壳完整、健康有力和性腺饱满的2龄文蛤作为亲贝, 采用阴干-流水刺激法进行人工催产, 通过隔离产卵和人工授精技术获得同步发育的文蛤幼体, 经镜检后取卵子、受精卵、2—4细胞、囊胚期、原肠胚、担轮幼虫、D形幼虫、壳顶幼虫、眼点幼虫和稚贝10个发育时期样品, 液氮速冻后, –80℃冻存备用。用于SNP分析的样品, 是从山东东营文蛤群体移养到浙江繁殖第六代的群体, 同批同塘养殖至2龄, 随机取样100颗, 测量壳长、壳宽、壳高、总重生长性状指标, 解剖取其斧足肌肉, 液氮速冻后, –80℃冻存备用。

1.2   总RNA提取与cDNA第一链合成

分别取文蛤不同组织和发育时期的样品, 采用Trizol法提取RNA, 用1%琼脂糖凝胶电泳和Nano Vue超微量分光光度计检测其浓度和完整性; 选择A₂₆₀/A₂₈₀在1.8—2.0、电泳检测条带完整性较好的RNA, 分别按照SMARTer RACE 5′/3′ Kit (Clontech)、Reverse Transcription System (Promega)反转录试剂盒说明反转录出cDNA第一链, –20℃保存备用, 用于后续RACE克隆、cDNA全长验证和荧光定量PCR实验。

1.3   cDNA全长克隆及其验证

基于文蛤454转录组文库, 利用NCBI的Blastx工具与其他物种比对分析, 获得Mm-Smad1/5 基因的EST序列, 用Primer Premier 5软件设计5′端、3′端RACE引物GSP1和GSP2(表 1), 上述用于RACE克隆的cDNA为模板, 依照Advantage 2 Polymerase试剂盒(Clontech)说明进行5′端、3′端RACE克隆。PCR反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后, 选择单一性、亮度高的条带利用胶回收试剂盒进行纯化后, 根据pEASY-T1 Cloning Kit试剂盒(Trans)说明进行连接转化, 挑选阳性克隆送往华大基因公司测序确认。依据获得Mm-Smad1/5基因的cDNA全长序列, 设计验证特异性引物F1和R1(表 1)对其cDNA全长进行验证, 以消除不确定的碱基来确保获得cDNA序列的正确性。

1.4   序列分析

用BlastX、DNAStar中的SeqMan程序对测序结果进行与其他物种比对、删除载体序列及拼接分析, ORF Finder查找ORF区, DNAMAN软件预测编码氨基酸序列。利用ExPASy软件预测蛋白的理化性质参数, SignalP 4.0 Server和TMHMM Server v2.0预测蛋白质信号肽和跨膜区域, NetNGlyc 4.0 Server、NetOGlyc 1.0 Server程序预测N-糖基化、O-糖基化位点。用ExPASy、Swiss Model在线预测蛋白质的结构域、二级结构。从GenBank数据库下载其他物种的同源氨基酸序列, 用MEGA 6.0软件进行同源氨基酸多序列比对, 采用邻位连接法(Neighbor-joining method)构建系统进化树(Bootstrape=1000)。

1.5   不同组织、不同发育时期差异表达分析

采用实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)对Mm-Smad1/5基因在不同组织和不同发育时期中表达量进行研究, 依据获得的cDNA全长序列设计引物qRT-F和qRT-R(表 1), 以18S rRNA基因为内参, 以不同组织和不同发育时期的cDNA为模板, 每个样品做4个平行, 用7500 Fast Real-Time PCR仪进行实时荧光定量PCR反应。PCR反应体系为SYBR^®Green Supermix (Bio-rad) 10 μL、DEPC-H₂O 7.2 μL、F 1 μL、R 1 μL、cDNA 0.8 μL, 共20 μL。PCR反应程序为95℃ 20s; 95℃ 3s, 60℃ 15s, 72℃ 10s, 共40个循环。实时荧光定量数据采用2^–ΔΔCt法计算, 数据以平均值±标准差(Mean±SD)表示, SPSS19.0软件进行ANOVA单因素方差分析, P<0.05为显著性差异水平。

表  1  本实验所用引物及其序列

Table  1.  Primers and their sequences

引物 Primers	引物序列 Sequences (5′—3′)	引物信息 Information of primers
GSP1	AGTTGTGGACGGTTTTACAGACCCCTCG	RACE克隆
GSP2	GCGTGGAATGCCTCGCCTACCCT
F1	AGAAGTGGGCGGAGAAAGC	全长验证
R1	GCCCATCTGAGTGAGAACTTTAT
qRT-F	ATGGGCTTCCTGGACCTGA	qRT-PCR引物
qRT-R	AGTCCCACGATACAGCGAGTT
18s-F	CTTTCAAATGTCTGCCCTATCAACT	qRT-PCR引物
18s-R	TCCCGTATTGTTATTTTTCGTCACT
F2	AGGGATGTCCTCCACTATATCTAG	SNP位点筛选
R2	GCATACTTGTGTCCATCGGCT
F3	GTCCCACGATACAGCGAGTT	SNP位点筛选
R3	GCAAACACTTCACCACCCAC
F4	GACCCCTCAAACAACGCT	SNP位点筛选
R4	TTTATGACAAATGTTCAGTGCTT

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1.6   外显子区域SNP位点筛查

根据获得的Smad1/5基因cDNA全长设计筛选外显子区域SNP位点3对特异性引物F2和R2、F3和R3、F4和R4(表 1), 提取备用100颗文蛤RNA反转录成cDNA, 作为外显子区域SNP位点筛选模板, PCR反应体系为Taq MasterMix 25 μL、DEPC-H₂O 17 μL、F 2 μL、R 2 μL、cDNA 2 μL, 共50 μL。PCR反应程序为94℃ 5min; 94℃ 30s, Tm 30s, 72℃ 1min, 共35个循环; 72℃ 10min。在扩增产物经电泳检测后, 将目的片段大小的PCR产物直接送往华大基因公司测序。利用MEGA软件对测序结果比对来查找SNP位点, 利用Chromas软件查看测序图谱来进行人工校对, 用SPSS19.0软件对壳长、壳高、壳宽和总重等生长性状与SNP位点基因型进行相关性分析。

2.   结果

2.1   Mm-Smad1/5的cDNA全长及其序列分析

Mm-Smad1/5基因的cDNA全长为1832 bp (GenBank登录号: KX257418), 包括5′端非编码区162 bp, 开放阅读框1380 bp, 编码459个氨基酸, 3′端非编码区290 bp。Mm-Smad1/5蛋白分子量为51.17 kD, 理论等电点pI是6.34, 其极性氨基酸所占比例为59.0%, 表现为亲水性。SignalP、TMHMM在线预测显示无明显的信号肽序列和无明显的跨膜区。NetNGlyc 4.1 Server、NetOGlyc 1.0 Server软件预测有2个N-糖基化、19个O-糖基化的位点。

2.2   Mm-Smad1/5基因编码的蛋白结构预测

ExPASy PROSITE结构域软件预测结果显示, Mm-Smad1/5蛋白包括MH1结构域(17—141 aa)和MH2结构域(265—459 aa)。Swiss Model二级结构预测显示, Mm-Smad1/5蛋白的二级结构由15个α-螺旋、19个β-折叠、58个转角和238个氢键组成。

2.3   Mm-Smad1/5基因的氨基酸比对及进化树分析

氨基酸序列比对结果显示, 文蛤Smad1/5蛋白与太平洋牡蛎Smad5、大西洋舟螺Smad1的同源性最高, 其一致性分别为83.7%和80.2%; 与果蝇Mad的一致性为69.3%, 同源性最低; 与非洲爪蟾、鸡、猪、人等脊椎动物Smad1、Smad5基因的同源性也较高, 达到70.3%以上。构建系统进化树结果显示, 用于分析的Smad成员分为BMP激活R-Smad、TGF-β激活R-Smad、Co-Smad和I-Smad四支, 与Smad蛋白家族的分类相同。文蛤Smad1/5属于BMP激活R-Smad支, 先与进化关系最近的大西洋舟螺的Smad1、栉孔扇贝Smad5、泥蚶Smad1/5、太平洋牡蛎Smad5和合浦珠母贝Smad5聚成一类, 再与人、鼠、鸡、非洲鸵鸟、扬子鳄、中华鳖、大西洋鲑、斑马鱼Smad5聚成的亚支和人、鼠、鸡、绒啄木鸟、非洲爪蟾、热带爪蟾、斑马鱼Smad1聚成的亚支聚在一起(图 1)。

图  1  采用MEGA6.0软件NJ法构建的进化树

Figure  1.  The phylogenetic tree, constructed by MEGA6.0 software using the NJ method

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2.4   Mm-Smad1/5基因在不同组织、发育时期的表达差异分析

Mm-Smad1/5基因在不同组织中表达分析显示, 在鳃、水管、内脏团、闭壳肌、外套膜和斧足六个组织中均有表达, 其中鳃、水管、内脏团和闭壳肌的相对表达量较低, 而外套膜和斧足的表达量显著高于其他组织(P<0.05), 其中斧足的表达量最高(图 2)。对Mm-Smad1/5基因在不同发育时期的表达进行分析, 发现从卵子、受精卵、2—4细胞期到囊胚期仅有微量表达, 从原肠胚期开始大量表达, 到壳顶幼虫期的表达量达到最高, 显著高于其他发育时期(P<0.05), 眼点幼虫期表达量大量下降, 稚贝期又有所上升(图 3)。

图  2  Mm-Smad1/5在文蛤不同组织中表达差异分析(n=4)

*代表显著性差异, P<0.05

Figure  2.  Analysis of Mm-Smad1/5 gene expression in different tissues (n=4)

* represented the significant differences at P<0.05

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图  3  Mm-Smad1/5在文蛤不同发育时期中表达差异分析(n>500)

不同字母代表显著性差异, P<0.05

Figure  3.  Analysis of Mm-Smad1/5 gene expression in different developmental stages (n>500)

Different letters represented the significant differences at P<0.05

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2.5   Mm-Smad1/5外显子区中SNP位点筛选与生长相关性分析

从100颗文蛤中剔除测序失败的个体后, 将剩余个体经序列比对分析, 发现在Mm-Smad1/5基因外显子区域共筛查出9个SNP位点, 根据相对于起始密码子(ATG)位置分别命名为123 A>G、262 C>T、551 C>T、919 C>T、936 G>T、996 G>T、999 C>T、1281 A>G和1403 G>T(表 2), 其中位点936 G>T的GG型的壳长、壳高、壳宽和总重生长指标均显著高于GT型(P<0.05), 而其他8个位点的不同基因型之间与生长性状的相关性均无显著性差异(P>0.05)。在9个SNP位点中, 其中7个(123 A>G、262 C>T、919 C>T、936 G>T、996 G>T、999 C>T和1281 A>G)属于外显子上的同义突变, 1403 G>T位点属于3′UTR区的突变, 这些突变并未导致编码氨基酸的改变; 551 C>T为外显子上的非同义突变位点, 其编码的氨基酸由亮氨酸(GCC)变成缬氨酸(GTC), 虽然该位点与生长相关性没有达到显著性水平(P>0.05), 但其CC型个体在壳长、壳高、壳宽和总重总体上要高于其他基因型。

表  2  Mm-Smad1/5基因外显子区中SNPs的不同基因型与生长性状相关性分析

Table  2.  Correlation analysis of the different genotypes of SNPs in the exon of Mm-Smad1/5 with growth traits

位点 Locus	基因型 Genotype	样本数 Sample	所占比例 Percent (%)	壳长 Shell length (mm)	壳高 Shell height (mm)	壳宽 Shell width (mm)	总重 Total weight (g)
123 A>G	AA	42	56.00	38.01±4.03	32.09±2.42	19.25±1.69	15.41±3.73
	AG	26	34.67	38.73±3.74	32.40±2.95	19.46±2.10	15.49±4.42
	GG	7	9.33	37.33±2.47	31.62±2.17	19.03±1.66	14.38±2.97
262 C>T	TT	48	64.00	38.81±4.03	32.14±2.48	19.35±1.65	15.55±3.58
	TC	15	20.00	38.17±3.42	31.99±2.74	19.02±2.03	15.07±4.26
	CC	12	16.00	38.78±0.84	33.52±0.32	20.32±0.90	17.02±0.07
551 C>T	CC	52	69.33	37.97±3.71	32.01±2.41	19.24±1.64	15.22±3.60
	TC	23	30.67	38.24±3.96	32.10±3.30	19.08±2.41	15.14±5.17
	CC	10	13.33	38.55±1.00	32.42±1.01	19.62±0.94	16.04±1.01
919 C>T	TT	38	50.67	37.67±3.98	31.81±2.76	19.01±1.87	15.10±4.03
	TC	27	36.00	39.05±1.43	32.89±1.39	19.95±1.28	15.51±2.87
936 G>T	GG	49	65.33	37.99±3.74a	32.05±1.57a	19.22±0.77a	15.35±1.81a
	GT	26	34.67	33.80±1.46b	28.01±0.29b	16.33±0.15b	9.87±0.08b
996 G>T	GG	55	73.33	37.74±3.84	31.83±2.57	19.10±1.74	15.10±3.77
	GT	17	22.67	38.94±2.08	32.96±1.49	19.59±1.55	15.92±2.42
	TT	3	4.00	36.64±2.51	30.56±3.15	18.22±2.18	13.39±4.58
999 C>T	CC	53	70.67	37.81±3.72	31.89±2.52	19.10±1.73	15.09±3.65
	TC	22	29.33	37.86±2.60	31.79±3.49	19.17±2.69	15.70±5.91
1281 A>G	AA	10	13.33	38.38±0.71	32.86±1.07	19.97±0.94	16.32±0.98
	AG	18	24.00	36.7±6.00	31.99±2.90	19.20±1.95	15.83±4.62
	GG	47	62.67	37.95±3.09	31.70±2.60	18.92±1.77	14.69±3.58
1403 G>T	TT	53	70.67	37.92±3.93	32.04±2.69	19.21±1.89	15.47±3.94
	TG	22	29.33	38.37±1.45	32.23±1.14	19.07±0.85	15.04±1.44
注: 同一位点组合中同列的不同小写字母表示生长性状显著性差异, P<0.05 Note: Different superscript letters in a column of each locus indicated the significant difference at P<0.05

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3.   讨论

Mm-Smad1/5基因在文蛤斧足、外套膜、鳃、闭壳肌等成体6个组织中均有表达, 这说明其参与多种组织细胞的生物学活性。Eva等^[20]发现Smad1、Smad5蛋白介导BMP2信号通路能够激活生肌负调控因子Id1、Id3、Dlx2和Hey1的表达, 来抑制C2C12细胞系的成肌分化; Ono等^[21]发现通过敲除Smad4、Smad5基因或Dorsomorphin阻断Smad1和Smad5磷酸化后, 都能导致肌卫星细胞的过早向成肌方向分化, 由此推断Smad1、Smad5蛋白在肌肉生长、分化过程中起到抑制作用。Mm-Smad1/5基因在斧足中表达最高, 这与泥蚶^[11]、栉孔扇贝^[12]的同源基因在肌肉组织中高表达具有一致性, 文蛤的斧足为重要运动器官, 主要由肌肉组织组成^[22], 推测其在文蛤肌肉生长过程中起到重要作用。Mm-Smad1/5基因在外套膜的表达量显著高于除足之外的其他组织, 可能由于外套膜为软体动物贝壳形成的重要组织^[23], 作为BMP-Smad信号通路下游效应分子, 发挥类似高等动物骨、软骨等硬组织形成的功能, 可能参与贝壳形成、矿化过程^[23]。

在文蛤卵子中检测到Mm-Smad1/5微量水平的表达, 可能为母源效应基因。在脊椎动物的胚胎发育早期, Smad1、Smad5蛋白参与了胚胎的背侧化和决定胚胎形态模式^[24], Mm-Smad1/5基因可能在文蛤胚胎发育早期发挥着类似功能。在原肠胚期中的表达量显著上升(P<0.05), 这与太平洋牡蛎^[10]、栉孔扇贝^[12]相似, 可能也参与了原肠胚期中三胚层的形成与分化。Smad1、Smad5作为BMP信号通路下游转导蛋白, 二者在贝类贝壳形成、矿化时期发挥重要作用, 如欧洲帽贝(Patella vulgata) BMP2/4基因在贝壳形成组织的边缘高水平表达, 参与壳原基的形态构建、贝壳形成及壳发生速度的调控^[25]; 静水锥实螺(Lymnaea stagnalis) BMP2/4参与贝壳螺旋形成、外套膜的生长、贝壳矿化的过程^{[26, 27]}。在本研究中, Mm-Smad1/5基因在文蛤担轮幼虫至壳顶幼虫期中高水平表达, 推测其在贝壳形成和矿化中发挥重要调控作用。

目前有关Smad1、Smad5基因与生长相关SNP位点的报道很少, 在栉孔扇贝Smad1基因中并未发现与生长性状相关的SNP位点^[12], 而泥蚶的Smad1/5编码区发现了6个突变频率较低的SNP位点^[11]。本研究在Mm-Smad1/5基因的外显子区域共筛查出9个候选SNP位点, 其突变频率高于泥蚶, 提示Mm-Smad1/5基因多态性更丰富。在文蛤的外显子筛查出的9个SNP位点, 大多数的SNP位点为同义突变, 未导致编码氨基酸的改变; 只有551 C>T为非同义突变, 与生长相关性并未达到显著性水平(P>0.05); 与文蛤生长显著性相关的位点936 G>T (P<0.05)虽未导致氨基酸的改变, 可能通过影响mRNA二级结构的稳定性或影响核糖体通过mRNA的速度来影响蛋白翻译^[28], 进而影响Mm-Smad1/5调控核内靶基因转录, 可能使得在文蛤壳长、壳高、壳宽和总重等生长性状上, 纯合GG型个体显著高于杂合GT型个体。本研究仅在编码区发现了1个与生长性状相关的SNP位点, 需要进一步对Mm-Smad1/5基因的内含子和启动子生长相关的SNP位点进行筛查, 以期为文蛤的良种选育提供更多有用的分子标记。