人工湿地是一种高效的水质改善系统, 作为人工湿地重要组成部分之一, 湿地植物起着至关重要的作用。在人工湿地系统中, 植物有以下作用: 拦截大颗粒物质、吸收营养物质、强化微生物活性、加强水利传输等^[1—3]。但是大多湿地植物都是草本植物, 到了气温低下的冬天, 会进入休眠期, 甚至枯萎死亡, 从而导致人工湿地系统污水净化效率下降^[4—6], 这严重制约了人工湿地系统在寒冷地区的推广应用^{[7, 8]}, 所以提高湿地植物的抗寒性刻不容缓。

目前提高植物抗寒性的方法主要有抗寒栽培技术、基因工程、杂交育种和诱变育种等。其中, 辐射诱变育种技术的优点包括突变率高、育种周期短、操作简单、生物安全性高等, 被广泛应用于农业、园艺、药材等领域, 并且已经取得了一定进展。早期的研究发现, 低剂量的γ射线照射种子可以提高番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)的出苗率和幼苗的抗病性^[9]。低剂量γ射线照射能够促进水稻(Oryza sativa L.)和绿豆(Vigna radiata (Linn.) Wilczek)的生长, 辐照后的水稻和绿豆长得更高, 穗数更多, 果荚更多, 颗粒更饱满^[10]。有研究发现, 辐照处理后的水稻在盐胁迫下生长更旺盛, 生物量更大, 表明低剂量γ射线照射能够增强植物的耐盐性^[11]。Hamad等^[12]研究发现, 低剂量γ射线能够减轻重金属镉胁迫对萝卜植株生长的影响, 表现为促进种子萌发和幼苗生长。此外, 经过20 Gy γ射线辐照的大豆种子, 幼苗耐旱性更好, 产量更高^[13]。众多研究表明, 低剂量γ射线对植物生长发育有积极的生物学效应, 但目前关于辐射诱导提高湿地植物抗寒性的研究还未见报道。因此, 有必要对辐射后的湿地植物在低温下的生理反应进行研究。

美人蕉(Canna indica L.)属多年生植物, 具有生长快、生物量大、适应能力强等特点, 被广泛应用于人工湿地系统。然而, 迄今为止, 没有相关研究表明γ射线能够提高美人蕉的耐寒性, 从而提高人工湿地在低温状态下的净化效果。本研究将辐照诱变育种技术应用于湿地美人蕉, 为其抗寒育种提供一定理论基础, 并将抗寒性得到提高的美人蕉种植于人工湿地, 为突破人工湿地越冬瓶颈提供新思路。

1.   材料与方法

1.1   植物处理与栽培

黄花美人蕉种子在湖北省农业科学院农产品加工与核农技术研究所进行辐照处理, 辐射源采用⁶⁰Co-γ, 剂量率为6 Gy/min剂量梯度设置为25、45、60 Gy, 未辐照组作为空白, 用0表示。辐照后的种子用热水浸泡24h后种植于普通泥土中, 待种子萌发, 幼苗长至30 cm左右高后, 取长势相近的美人蕉幼苗移植于塑料盆中, 每组设置3个平行。

将盆栽美人蕉置于低温光照培养箱中进行阶段性降温培养, 温度梯度设置为20℃、15℃、10℃、5℃和0, 每个温度持续3d, 3d后降温到下一温度, 同时采集美人蕉叶片用于生理生化指标的测定。

1.2   植物生理生化指标测定

SOD测定采用氮蓝四唑法、CAT测定采用过氧化氢比色法、POD采用愈创木酚法、丙二醛测定采用硫代巴比妥酸法、脯氨酸采用茚三酮显色法、总可溶性糖采用蒽酮-硫酸比色法、可溶性蛋白质采用考马斯亮蓝G-250法^[14]。

1.3   抗寒性系数

α=A/A_CK

A是5℃下各指标的测量值。A_CK是20℃下的测量值。

1.4   试验装置与方法

本研究采用垂直流人工湿地, 装置为20 cm×20 cm×40 cm的长方体玻璃钢(四周及底涂黑), 装置内填充粒径2—5 mm的沸石, 填充高度为35 cm。试验设置2个处理水平, 2组分别种植未辐照处理的美人蕉和45 Gy辐照美人蕉, 每个装置内种植一株美人蕉, 种植深度10 cm (图 1)。

图  1  试验装置图

Figure  1.  Illustration of test installation

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进水采用自配水, 配方如下: 蛋白胨, 80 g/m³; 牛肉膏, 55 g/m³; 葡萄糖, 100 g/m³; NaCl, 3.5 g/m³; NH₄Cl, 28.5 g/m³; CaCl₂, 2 g/m³; MgSO₄, 1 g/m³; K₂HPO₄, 19 g/m³。主要指标为COD (195.4±22.7) mg/L; TN (22.84±1.42) mg/L; TP (2.47±0.33) mg/L。进水方式采用序批式, 水力停留时间为3d。

1.5   数据分析

用单因素方差分析对植物生理生化指标进行比较分析, 为了综合分析各生理指标间的关系, 对各指标进行因子分析。用独立样本T检验和Mann-Whitney U检验对辐照组和对照组人工湿地的污染物去除率进行比较, 各分析的显著性水平为P<0.05。统计分析软件用SPSS 17.0, 用Origin8绘制相关图形。

2.   结果

2.1   各辐照组抗寒性评价结果

不同温度下各处理组抗氧化酶活性变化　　由图 2可知, 当T≥10℃时, 各组间SOD活性没有显著性差异, 当温度降至5℃及以下时, 45 Gy及60 Gy辐照组活性显著性高于对照组(P<0.05), 在0℃下。从整体上看, CAT活性随着温度呈现先上升后下降的趋势, 在20℃、15℃、5℃下, 经过辐照处理的美人蕉CAT活性显著高于未辐照组(P<0.05), 而当温度降至0℃时, 各组CAT活性均急剧下降至趋近于0。在20℃下, 对照组POD活性显著高于其他辐照处理组, 随着温度的不断降低, 这种差异不断缩小, 而当温度降至5℃时, 除25 Gy组外, 其他辐照组POD活性均显著高于对照组, 其中45 Gy组活性最高。在0℃时25 Gy组和45 Gy组POD活性显著性高于对照组。

图  2  在不同温度下不同辐照剂量对美人蕉SOD (a)、CAT (b)和POD (c)活性的影响

Figure  2.  Effects of different irradiation doses on activities of SOD (a), CAT (b), and POD (c) in CIL seeds under different temperatures

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在不同温度下各处理组膜质过氧化程度变化　　本研究MDA的测定结果如图 3所示。当T≥10℃时, 丙二醛含量几乎不变, 辐照组与未处理组间无显著性差异。当温度降至5℃和0℃时, 对照组MDA大量积累, 辐照处理组MDA含量显著低于对照组。

图  3  在不同温度下不同辐照剂量对美人蕉丙二醛的影响

Figure  3.  Effects of different irradiation doses on malondialdehyde in Canna indica L. under different temperatures

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不同温度下各处理组渗透调节物质变化　　脯氨酸、总可溶性糖、可溶性蛋白质的测定结果如图 4所示, 随着温度的降低各组脯氨酸均有所积累, 而温度降低至0℃时, 脯氨酸含量有所降低, 在10℃和5℃下, 45 Gy组含量显著高于对照组。当温度较高(T≥10℃)时, 各组总可溶性糖含量均处于较低水平, 当温度降低至5℃时, 各组糖含量均有所增加, 辐照组含量显著高于对照组, 在0℃下, 各组可溶性糖大量积累, 45 Gy和60 Gy组含量显著高于对照组。对照组可溶性蛋白质含量随着温度降低不断降低, 而辐照处理组降低程度明显低于对照组, 在5℃下, 45 Gy组蛋白质含量显著高于对照组, 在0℃下, 各辐照处理组含量均显著高于对照组, 其中45 Gy组含量最高。

图  4  在不同温度下不同辐照剂量对美人蕉脯氨酸(a)、总可溶性糖(b)、可溶性蛋白质(c)含量的影响

Figure  4.  Effects of different irradiation doses on proline (a), total soluble sugar (b) and soluble protein (c) content in Canna indica L. under different temperatures

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因子分析　　因子分析可以克服单项指标的局限性, 提高评价的客观性、全面性和科学性。为了综合评价各组抗寒性, 我们对各项指标进行标准化, 得到各组的抗寒性系数, 然后应用因子分析的统计分析方法对抗寒性系数进行了分析, 最终因子得分结果见表 1。结果表明, 辐照处理组得分明显高于对照组, 其中45 Gy组得分最高。所以, 辐照处理美人蕉种子可以有效提高美人蕉的抗寒性, 最佳辐照剂量为25—45 Gy。

表  1  各处理组美人蕉抗寒系数因子得分

Table  1.  Scores of cold resistance for CIL in each treatment group

主成份Component	特征值(旋转后) Eigenvalues (rotated)	因子得分Score of factors
		0	25 Gy	45 Gy	60 Gy	80 Gy
F1	3.727	0.696	1.385	2.044	1.101	0.964
F2	2.119	1.134	0.779	0.970	0.584	0.892
综合因子 Comprehensive factor (F)		0.855	1.165	1.655	0.914	0.938

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2.2   人工湿地低温状态下净化效果

人工湿地运行期间实测温度如图 5所示, 处理和对照组TP、TN、COD去除率测定结果见图 6。对TP去除率分析可知, 随着时间的推移, 两组去除率均呈下降趋势, 可能是因为基质吸附作用的减弱。种子辐照组的TP去除率一直显著高于对照组(P<0.05), 试验期间对照组TP平均去除率为27.24%, 种子辐照组平均去除率为42.51%, 是对照组的1.56倍。由TN去除率结果可知, 前期两组TN去除率没有显著性差异且处于较平稳状态, 而自最低温度下降至零下开始(1月3日), 两处理组TN去除率均有所下降, 种子辐照组的去除率略高于对照组。而对照组和辐照组间COD去除率没有显著性差异。

图  5  冬季应用试验期间温度实测图

Figure  5.  Illustration of temperature measurement during winter

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图  6  45Gy种子辐照组和对照组冬季TP (a)、TN (b)和COD (c)去除率趋势图

Figure  6.  Removal rates of TP (a), TN (b), and COD (c) in the group of CIL in constructed wetland by using 45 Gy dose of gamma ray and control group in winter

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3.   讨论

3.1   各辐照组抗寒性比较分析

在通常情况下, 植物体内自由基的产生和清除是保持动态平衡的, 当有外界条件影响或处于逆境时, 这种动态平衡被打破, 自由基大量积累。但自由基性质极为活泼, 过多残留体内不能被及时清除时, 它们将会攻击各种生物大分子, 引起DNA损伤、酶失活、脂质氧化等问题, 进而导致生物体的生理病变。植物的抗氧化系统, 是维持机体自由基产生和消除保持动态平衡的代谢系统, 对植物体进行正常的生理活动有着十分重要的意义。植物体内的抗氧化系统分为酶促清除系统和非酶促清除系统, 酶促清除系统主要是指抗氧化酶类, 包括SOD、POD、CAT等, 它们可以增强植物的抗逆性^[15—18]。作为活性氧清除系统中第一个发挥作用的酶, 当植物受到环境胁迫时, SOD作为一种细胞保护酶发挥作用。大量的实验结果表明, 超氧化物歧化酶在提高植物耐寒性方面起着重要的作用^[19]。在晚冬抗冷锻炼中多年生牧草根中SOD和CAT的活力快速增加^[20]。SOD和CAT不仅可以清除体内过量的活性氧, 在细胞H₂O₂信号传导中也扮演着重要角色^{[21, 22]}。POD作为活性较高的适应性酶, 能够反映植物的生长特性、代谢状况和对外界环境的适应性。有研究表明, 环境胁迫可以诱导POD活性的提高, 且POD活性高低与植物抗逆性密切相关^[23]。对各组SOD酶活性测定发现, 当温度降至5℃时, 各组SOD活性有所增加, 而当温度降至0℃时, 各组SOD活性明显下降。在5℃, 随着照射剂量的增加, SOD活性先升高后降低, 在45 Gy达到高峰。在0℃下也发现了同样的趋势。由此可以看出, 辐照处理可以提高低温下美人蕉SOD活性, 而SOD活性的提高有助于美人蕉抵御低温伤害。当T≥5℃时, 辐照处理组美人蕉CAT活性一直高于对照组, 而当温度降至0℃时, 各试验组美人蕉CAT活性均急剧下降到趋近于0, 说明辐照处理对美人蕉的抗寒性提高有一定帮助, 但是当温度达到0℃时, 即使是经过辐照处理的美人蕉也受到了很大的低温伤害。在20℃下, 对照组POD活性显著高于辐照组, 随着温度的降低对照组POD活性不断降低, 辐照组活性反而有所增高, 在5℃下辐照组POD活性显著高于对照组。结果表明, 辐照处理可提高低温下美人蕉的POD活性, 从而消除低温胁迫产生的多余ROS, 有助于抵御低温伤害。

MDA是检测低温植物损伤的常用指标之一^[24]。在低温胁迫下, 植物产生大量活性氧自由基, 引发膜质过氧化, 最终生成丙二醛^[25], 且膜脂过氧化程度随温度下降而加重^[26]。本研究结果表明, 在低温下未辐照处理组膜质过氧化程度更高, 辐照处理后的美人蕉抗寒性更高。

脯氨酸是可以保护植物免受单线态氧和自由基损伤的唯一的水溶性溶质, 它不仅可以结合单线态氧, 还可以有效地清除羟自由基, 稳定蛋白质、DNA和细胞膜^{[27, 28]}。有研究表明脯氨酸含量的增加可以提高烟叶(Nicotiana tabacum L.)的耐冷性^[29]。脯氨酸的积累可以增加细胞液浓度, 起到保护细胞的作用^[30]。此外, 脯氨酸能提高抗氧化酶的活性, 有助于清除多余的活性氧。在低温下辐照组脯氨酸含量高于对照组, 由此可见, 辐照处理组更能适应低温环境。已有研究表明, 植物抗寒性与可溶性糖含量密切相关^[31], 本研究结果表明辐照可以提高美人蕉低温下的糖含量, 从而减轻低温带来的伤害。可溶性蛋白具有较强的亲水性, 可以和低分子量的糖一起聚集在叶绿体和细胞器周围, 增强细胞的保水能力, 降低冰点, 防止细胞内结冰。大多数研究表明, 蛋白质含量的增加与植物抗寒性呈正相关^[32]。本研究发现, 在受到低温胁迫时, 美人蕉蛋白质含量会降低, 而辐照组降低程度小于对照组, 在0℃下45 Gy辐照组蛋白质含量显著高于其他组。综上所述, 辐照能够提高美人蕉叶片中渗透调节物质浓度, 从而提高美人蕉抗寒性。

3.2   人工湿地低温状态下净化效果比较分析

众多研究表明冬季低温对磷的去除影响较大, 冬季TP的去除率比夏季低6.1%—34.0%^[33]。辐照美人蕉显著提高了人工湿地在冬季低温下的TP去除率, 人工湿地对磷的去除主要靠基质吸附、植物吸收以及微生物的同化^[34]。已有研究表明, 用于二级处理植物吸收氮量约占去除量的8%—16%, 植物吸收去除氮的作用不明显^[35]。研究者普遍认为微生物的硝化/反硝化是人工湿地脱氮的主要途径^[36]。众多研究者认为, 人工湿地即使在冬季低温下对COD也有较高去除率^[33], 在本研究中, 对照组和辐照组冬季COD去除率平均值均可达70%以上。

4.   结论

辐照处理能够提高低温下美人蕉叶片中的抗氧化酶SOD、POD和CAT的活性, 提高脯氨酸、可溶性糖、蛋白质含量, 降低丙二醛含量, 从而减少低温带来的生理损伤, 种子最佳辐照剂量为45 Gy, 45 Gy辐照美人蕉种子能够显著提高人工湿地冬季TP去除率。