乌龟繁殖生态的研究
STUDIES ON THE BREEDING ECOLOGY OF THE TORTOISE, CHINEMYS REEVESII(GRAY)
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摘要: 乌龟大部分时间生活在水中,但要经常游出水面呼吸空气和摄食,夏秋时节有爬在岸边晒太阳的习性,冬、春两季有蛰伏休眠的习性。乌龟产卵季节和产卵窝数主要受温度制约,在湖南产卵时间为5—8月,产卵高峰出现在7月上旬,产卵多在夜间进行,龟卵一般产在高出水平面30厘米以上的泥土中。龟无护卵和孵卵的本能,龟卵在自然界靠地温孵出稚龟来,但人工孵化可使龟卵的孵化率提高到87.6%以上,孵化时间可以缩短到64天左右。Abstract: The breeding season of tortoise lasts from May to August, but the peak of spawning occurs in the first ten-day of July. The temperature for breeding was found to be 20-38℃ and the optimal temperature at 31℃. The eggs were laid in nest situated 30 cm above water surface. The construction of nests for egglaying was carried out mainly by the females at night. Nests were digged vertically, being about 50 mm in depth, with a diameter of about 41ram at the opening and 50 mm around the bottom. Clutch size varied from 1 to 13 eggs, with a mean of 5.6 eggs. Eggs are ellipsoidal, white in color and opaque. The relationship between weight (W) and axis (L1 L2) of egg may be expressed as W=0.001405+0.186111 and W=0.000589+0.332912 When the number of females were three times as that of males, the average fetilization rate of eggs were estimted to be 79.73%. Accumulated temperature for hatching were 4125°C.h. The incubation lasted 64.39 days (indoor) and 76 days (outdoor) and the hatching rates were 87.6% (indoor) and 15.79--55.6% (outdoor), respectively. Tortoise just hatched were 4.15±0.1037(g) in weight.Results of hatching rate in relation to several artificial hatching conditions are also dealt with in the paper.
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Keywords:
- Chinemys reevesii /
- Hatching rate /
- egg laying
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罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)作为世界上最大的淡水虾类, 原产于南亚、东南亚地区及大洋洲北部和西太平洋岛屿。自1976年引入我国以来, 罗氏沼虾养殖业经过几十年的发展与完善, 已经成为我国重要的水产养殖品种。然而近年来, 一种被称为罗氏沼虾“白头病”的疾病在我国沿海多个水产养殖地区暴发, 对罗氏沼虾的致死率极高, 严重制约了罗氏沼虾养殖业的发展[1]。经研究发现该病病原为十足目虹彩病毒1 (Decapod iridescent virus 1, DIV1), 隶属于虹彩病毒科十足目虹彩病毒属, 是一种可引发虾类高致死率的DNA病毒[2]。在感染DIV1后, 罗氏沼虾的行动变缓, 活力下降, 并表现出明显的症状, 包括空肠空胃、肝胰腺萎缩、头胸甲下有白色三角区(常被称作“白头”或“白点”)等。
温度作为水产养殖的重要环境因素, 不仅影响着水生生物的生长发育, 还能通过影响机体代谢水平来促进或抑制病毒和细菌入侵机体的能力[3]。有研究表明温度能够影响日本对虾(Penaeus japonicus)从感染WSSV初期到发病的快慢程度[4]; 另一研究表明, 高温能够减缓感染WSSV凡纳滨对虾(Litopenaeus Vannamei)的发病时间, 延长患病虾的生存期限[5]; 低温环境能够抑制WSSV对淡水鳌虾(Cambaroides dauricus)的致病性[6]。DIV1的暴发与水温有着密切相关性, 有研究认为养殖过程中平均水温为(24.6±3.3)℃时有利于减少疾病的发生。也有研究发现当水温为16—32℃时, 养殖虾体内可检测到DIV1, 但温度高于32℃则检测不到病毒[7], 因此水温调控可以作为预防DIV1的措施之一。目前, 关于温度对罗氏沼虾感染DIV1的调控机制尚不清楚, 罗氏沼虾养殖业缺乏对DIV1的有效防控措施。
近年来, 转录组学已被广泛应用于虾类抗病毒免疫机制的研究中, 主要涉及病毒感染宿主后一些免疫相关的差异表达基因筛选和关键信号通路的发现[8]。如Xue等[9]对感染WSSV的凡纳滨对虾的血淋巴细胞进行转录组测序分析, 发现感染WSSV早期时一些模式蛋白、血蓝蛋白和原酚氧化物酶的表达发生上调, 而感染晚期时基因除了富集到免疫相关通路外, 还涉及糖酵解、氨基酸以及核苷酸等代谢相关通路。随着测序技术迈入新的发展阶段, 关于虾类抗病毒免疫机制的研究愈加深入, 许多免疫基因和信号通路也被逐渐获知。Liao等[10]在感染WSSV对虾的转录组测序中发现了一些与DIV1抗性相关的基因及通路, 如MAPK、Wnt、Toll-like receptor及p53信号通路等免疫相关的信号通路, 还包括磷酸丙糖异构酶、热休克蛋白70和C型凝集素等基因, 其中一些基因还富集到了糖酵解/糖异生、氨基酸生物合成等代谢相关的通路。
为深入探究温度对罗氏沼虾感染虹彩病毒的影响, 本研究通过设置不同温度梯度, 研究了不同温度作用下罗氏沼虾感染DIV1后的存活率以及病毒载量的变化; 此外, 利用转录组学分析了温度对罗氏沼虾感染DIV1的免疫调控机制。综上, 本研究为进一步阐明罗氏沼虾抗DIV1的分子机制及开发相关病毒防控技术提供了参考依据。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
试验用罗氏沼虾均采自淡水水产研究所养殖基地, 随机采样检测其不携带DIV1等病原, 于实验室循环养殖系统中暂养, 确认无死亡后开始试验。高盐缓冲液PBS购自赛默飞世尔生物化学制品有限公司, 质粒小提试剂盒购自天根生化科技有限公司, FastStart Essential DNA Probes Master购自罗氏诊断产品有限公司, PCR反应体系购自北京梓熙生物科技有限公司, 反转录试剂盒及反转录体系均购自TaKaRa公司。病毒粗提液通过采集感染DIV1的罗氏沼虾组织进行制备, 取患病虾的肝胰腺1:1加入高盐缓冲液PBS, 匀浆后4500 r/min离心15min, 通过0.45 μm滤膜过滤后使用。
1.2 不同温度下的人工感染实验
选择体长4—5 cm、体重16 g左右的健康罗氏沼虾, 随机分为5个不同温度(26、28、30、32和34℃)攻毒组与1组对照组, 每组10尾虾, 设置3个生物学重复, 每尾虾单独笼养, 罗氏沼虾于25℃水温中适应性养殖3d后进行升温, 待各试验组升温至规定温度后人工感染DIV1, 对照组设置为罗氏沼虾的最适生长温度26℃。参考刘小央等[11]建立的罗氏沼虾感染DIV1的攻毒模型, 感染组注射DIV1病毒粗提液(病毒浓度为3.23×103 copies/ng DNA) 0.1 mL, 未感染组注射同等剂量的无菌PBS缓冲液。攻毒后的24h和72h每试验组随机采集3尾虾的鳃、肝胰腺及肌肉。
1.3 病毒载量的测定
阳性对照质粒的构建及定量标准如下, 通过常规PCR针对病毒核心基因MCP基因进行扩增, 引物对和探针参考Qiu等[1]; 扩增后的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳后切胶回收, 再克隆到pMD18-T载体, 加入感受态细胞进行转化及扩大培养; 使用质粒小提试剂盒获得纯化后的DNA片段; 质粒浓度通过NanoDrop 2000分光光度计确定; 将质粒10倍梯度稀释, 并作为qPCR检测的模版。以病毒拷贝数为横坐标、Ct值为纵坐标构建标准曲线。测定罗氏沼虾感染DIV1后24h和72h肝胰腺、鳃及肌肉的病毒载量。20 µL qPCR反应体系: Mix 10 µL, 上下游引物(10 µmol/L)各0.5 µL, 探针(10 µmol/L) 0.2 µL, DNA模版1 µL, ddH2O 7.8 µL。反应条件: 95℃ 600s, 95℃ 10s、60℃ 20s、40个循环。数据通过SPSS 26.0软件进行单因素ANOVA检验来比较显著差异(P<0.05表示具有显著性差异)。
1.4 转录组测序
采集攻毒第72h的罗氏沼虾肝胰腺样品送至公司进行测序, 其中不同温度攻毒组分别为T26 (26℃)、T28 (28℃)、T30 (30℃)、T32 (32℃)、T34 (34℃), 对照组记为C, 每组3个平行。提取所有样品的总RNA, 检测质量及浓度; 通过Oligo (dT)磁珠富集具有polyA尾的mRNA, 将其随机打断; 以片段化mRNA为模板, 合成cDNA并纯化, 进行末端修复、连接接头; 筛选(400—500 bp) cDNA, PCR扩增后的产物进行纯化, 最终获得文库; 使用Agilent 2100 Bioanalyzer进行文库质检, 通过Illumina进行测序; 采用fastp (0.22.0)过滤3′端带接头的序列及低质量Reads, 最终获得的clean reads用于后续分析[12—13]。
1.5 差异表达分析
对于本次结果, 采用HTSeq (v0.9.1)对每个基因的Read Count值进行统计比对, 并将所得结果作为所测基因的初始表达量; 根据FPKM对不同样本及基因的表达量进行标准化; 最后基因的差异表达通过DESeq (v1.38.3)软件进行分析, 筛选出DIV1感染组和未感染组间的差异表达基因(筛选条件设置为: 表达差异倍数|log2FoldChange|>1, 显著性P-value<0.05)[13]。
1.6 差异基因的富集分析
本试验的富集分析主要在GO和KEGG数据库中进行比对分析。GO富集分析采用topGO (v2.50.0), 筛选差异基因显著富集的GO term (P-value<0.05), 探究该基因在宿主体内主要行使的相关生物学功能; KEGG富集分析采用clusterProfiler (v4.6.0), 重点关注显著富集的通路[13]。
1.7 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)
利用Trizol法提取感染DIV1后72h的罗氏沼虾肝胰腺的总RNA, 再通过NanoDrop 2000分光光度计测定浓度后统一调整至25 ng/μL, 使用反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA, 反转录体系: Mix 2 µL, RNA模版4 µL, ddH2O加至10 µL; 反应条件: 37℃ 15min, 85℃ 5s。本试验以β-actin作为内参基因, 利用RT-qPCR测定CAT、Cu/ZnSOD、CTL和ACP免疫基因的表达水平[11]。20 µL反应体系: Mix 10 µL, 上下游引物(10 µmol/L)各0.6 µL, cDNA模版1 µL, ddH2O 7.8 µL, 反应条件: 95℃ 30s, 95℃ 10s、60℃ 30s、72℃ 30s、循环40次。基因的相对表达水平利用2－△△Ct方法计算[10]。
2. 结果
2.1 不同温度条件下罗氏沼虾感染DIV1后的存活率
在26、28、30、32和34℃五种不同温度下, 对罗氏沼虾进行人工感染DIV1, 试验周期10d, 罗氏沼虾存活率见图 1。结果表明, 试验3d罗氏沼虾出现死亡, 7d试验组30℃以下温度的罗氏沼虾全部死亡, 试验结束时34℃中仍有较多罗氏沼虾存活, 试验中死亡虾均已进行DIV1检测。结果显示相较于其他温度组, 水温34℃时感染DIV1的罗氏沼虾, 其存活时间延长、死亡数量减少, 表明34℃水温能够延长感染DIV1罗氏沼虾的存活时间。
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图 1 罗氏沼虾在不同温度下感染DIV1后的存活率Figure 1. Survival rate of M. rosenbergii after infection with DIV1 at different temperatures2.2 不同温度条件下罗氏沼虾病毒载量的测定
成功构建DIV1 TaqMan荧光定量PCR标准曲线(图 2), 根据标准曲线计算人工感染罗氏沼虾24h和72h后的肝胰腺、鳃及肌肉组织的病毒载量(图 3)。试验结果表明, 罗氏沼虾感染DIV1的72h内肝胰腺、鳃及肌肉组织中的病毒迅速增殖。感染DIV1的罗氏沼虾其肝胰腺、鳃及肌肉在不同温度影响下的病毒复制程度有所不同, 感染第72h, 温度28℃时罗氏沼虾体内的病毒载量最高, 但随着温度升高至30℃及更高温度时, 肝胰腺、鳃及肌肉中的病毒载量逐渐下降。当温度到达34℃时, 罗氏沼虾体内的病毒载量明显低于其他温度, 并且34℃时感染DIV1 72h的病毒载量相较于感染第24h的增长并不明显, 表明34℃水温能够抑制罗氏沼虾体内的病毒复制。
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图 3 不同温度下感染DIV1 24h (A)和72h (B)罗氏沼虾的肝胰腺、鳃和肌肉组织中病毒载量的变化不同字母表示组间差异显著(P<0.05)Figure 3. Changes of viral load in hepatopancreas, gill, and muscle tissues of M. rosenbergii infected with DIV1 at different temperatures for 24h (A) and 72h (B)Different letters indicate significant differences in groups (P<0.05)2.3 转录组测序分析
采集感染72h后不同温度的罗氏沼虾肝胰腺样本进行转录组分析, 共有18个罗氏沼虾的mRNA测序文库。总共生成903203878个Raw Reads, 其中Q20和Q30均在98.24%、94.68%左右, 过滤后的clean reads共894538608个。感染组共获得767584660个clean reads, 其中Useful reads普遍在99.04%左右(表 1)。与参考基因组进行比对, 发现18个样本的比对率均在78.76%左右(表 2)。相关性分析发现同一样本的生物学重复, 基因表达水平的相关性均大于0.8, 表达模式相似度较高; 不同样本的基因表达水平的相关性普遍小于0.8, 表达模式相似度低(图 4)。综上表明本次测序结果质量普遍较好, 可用于后续分析。
表 1 罗氏沼虾感染DIV1的转录组测序数据(过滤后)Table 1. Transcriptome analysis data of hepatopancreas of M. rosenbergii infected with DIV1 (after filtering)Sample Raw read number Trimmed read number Trimmed bases Raw Q20 rate (%) Raw Q30 rate (%) Useful read (%) C1 40656152 40270600 6071846179 97.97 93.98 99.05 C2 45844954 45362930 6839330599 97.82 93.66 98.95 C3 41687698 41320418 6229797577 98.09 94.29 99.12 T26-1 50214336 49673918 7484682542 98.13 94.42 98.92 T26-2 52973998 52477322 7911017426 98.38 95.04 99.06 T26-3 48144434 47595962 7173781641 98.08 94.32 98.86 T28-1 51755682 51295874 7733108510 98.32 94.85 99.11 T28-2 57000770 56368302 8499234370 98.12 94.38 98.89 T28-3 47886244 47449286 7153565373 98.18 94.39 99.09 T30-1 53964458 53491966 8062804860 98.45 95.21 99.12 T30-2 45954522 45543808 6865548233 98.31 94.81 99.11 T30-3 52823954 52240446 7873885256 98.18 94.6 98.9 T32-1 53489536 53001530 7991157162 98.36 94.95 99.09 T32-2 56704528 56141238 8461995874 98.32 94.91 99.01 T32-3 54654938 54195174 8171456679 98.45 95.17 99.16 T34-1 50771510 50347114 7589411546 98.46 95.18 99.16 T34-2 49617766 49172430 7411627603 98.45 95.24 99.10 T34-3 49058398 48590290 7324474436 98.30 94.83 99.05 表 2 转录组测序数据与参考基因组的比对结果Table 2. The alignment results with transcriptome analysis data and the reference genomeSample Clean reads Total mapped
(%)Multiple mapped
(%)Uniquely
mapped (%)Mapped to
gene (%)Mapped to
InterGene (%)Mappe to
exon (%)C1 40270600 95.25 15.48 84.52 81.91 18.09 91.33 C2 45362930 95.69 15.57 84.43 81.78 18.22 91.46 C3 41320418 95.47 15.28 84.72 83.02 16.98 91.56 T26-1 49673918 94.19 14.86 85.14 68.91 31.09 87.51 T26-2 52477322 95.51 14.69 85.31 77.01 22.99 88.87 T26-3 47595962 95.23 16.36 83.64 73.20 26.80 86.50 T28-1 51295874 95.61 15.09 84.91 77.57 22.43 88.77 T28-2 56368302 95.70 17.06 82.94 77.30 22.70 89.94 T28-3 47449286 96.09 16.52 83.48 81.28 18.72 90.47 T30-1 53491966 95.36 13.22 86.78 81.49 18.51 90.10 T30-2 45543808 95.28 13.89 86.11 79.79 20.21 90.35 T30-3 52240446 95.07 20.53 79.47 72.44 27.56 88.57 T32-1 53001530 95.58 12.10 87.90 80.67 19.33 91.18 T32-2 56141238 95.92 20.38 79.62 79.01 20.99 90.01 T32-3 54195174 95.60 11.92 88.08 82.18 17.82 91.41 T34-1 50347114 95.47 11.43 88.57 81.52 18.48 90.96 T34-2 49172430 94.74 11.30 88.70 78.30 21.70 91.07 T34-3 48590290 95.00 13.84 86.16 80.25 19.75 91.06 ![]()
图 4 样本间基因表达的Pearson相关系数颜色代表相关系数; 绿色. 高相关; 白色. 中等相关; 棕色. 低相关Figure 4. Pearson correlation coefficient of gene expression in samplesThe color represents the correlation coefficient; green represents high correlation, white represents medium correlation, brown represents low correlation2.4 差异表达基因的鉴定与分析
分析发现感染和未感染DIV1的罗氏沼虾共有8,483个差异表达基因, 其中有3972个上调基因, 而下调基因则有4511个。比对到GO数据库, 注释结果主要包含分子功能(Molecular function, MF)、细胞组分(Cellular component, CC)和生物过程(Biological process, BP)。以C-vs.-T28、C-vs.-T32、C-vs.-T34为例, 共有948、1312、1023个GO通路中被差异表达基因所富集, 通过图 5所表明的三组样本前20个GO富集结果, 显示在CC中多数基因富集到了核糖体、核仁及细胞质等细胞器中; 在BP中基因大多富集到了酸类、胡萝卜素等调节代谢、RNA或核糖体等生物合成过程中; 在MF中基因大多富集到构成核糖体、催化氧化还原酶以及组成核糖体中。将差异基因比对到KEGG数据库, 注释结果主要包括基因信息处理(Genetic information processing)、细胞过程(Cellular processes)、生物系统(Organismal systems)、代谢(Metabolism)、环境信息处理(Environmental information processing)。以C-vs.-T28、C-vs.-T32、C-vs.-T34为例, 显著富集的Pathway分别有18、36、21个。图 6展示了三组样本前20个KEGG富集结果, 结果显示差异表达基因主要富集到了花生四烯酸代谢(Arachidonic acid metabolism)、不饱和脂肪酸的生物合成(Biosynthesis of unsaturated fatty acids)、α-亚油酸代谢(alpha-Linolenic acid metabolism)、氨基糖和核苷酸糖代谢(Amino sugar and nucleotide sugar metabolism)、糖酵解/糖异生(Glycolysis / Gluconeogenesis)、淀粉和蔗糖代谢(Starch and sucrose metabolism)、糖胺聚糖降解(Glycosaminoglycan degradation)等通路。推测这些差异表达基因富集的通路可能在DIV1感染罗氏沼虾的分子机制中发挥着重要作用。
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图 5 C-vs.-T28 (A)、C- vs.-T32 (B)、C- vs.-T34 (C)差异表达基因的GO富集分析Figure 5. GO enrichment analysis of differentially expressed genes in C- vs.-T28 (A), C- vs.-T32 (B), C- vs.-T34 (C)![]()
图 6 不同温度C- vs.-T28 (A)、C- vs.-T32 (B)、C- vs.-T34 (C)差异表达基因的KEGG富集分析Figure 6. KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes at different temperatures C-vs-T28 (A), C-vs-T32 (B), C-vs-T34 (C)表 3 不同温度感染组的富集通路及基因(部分)Table 3. Enrichment pathways and genes in the infected groups at different temperatures.(Part)Sample Up Down Total Enrichment pathway Enrichment gene C-vs-T26 499 787 1,286 Pentose and glucuronate interconversions DER、RDH、
Bco、HPSE、
art、CYP2、
ACP、Gba、
NAGA、PSAP、
CROT、Crot、
PEX、CROTRetinol metabolism Glycosaminoglycan degradation Ascorbate and aldarate metabolism Biosynthesis of unsaturated fatty acids Arachidonic acid metabolism Lysosome Peroxisome PPAR signaling pathway C-vs-T28 404 519 923 Retinol metabolism RDH、Bco、
CYP、art、
Cyp、UGP、
Gale、CAT、
SOD、Ctl、
Aga、Tspan4、
PicotBiosynthesis of unsaturated fatty acids Arachidonic acid metabolism Amino sugar and nucleotide sugar metabolism alpha-Linolenic acid metabolism Peroxisome Lysosome PPAR signaling pathway C-vs-T30 816 998 1,814 Amino sugar and nucleotide sugar metabolism PGM、Uap、
GALE、UGP、
Ctl、ANPEP、
Gclc、Casp、
GPX、SOD、
CYP、Pla、
RPS、RPLRetinol metabolism Glutathione metabolism Fructose and mannose metabolism Arachidonic acid metabolism Starch and sucrose metabolism Biosynthesis of unsaturated fatty acids Lysosome Peroxisome Ribosome C-vs-T32 1,148 1243 2,391 Ribosome AMY、TSPO、
Lrp、SLC、
CPA、PRCP、
Acp、PCK、
GMPPB、Ctl、
Gfus、PyK、Carbohydrate digestion and absorption Cholesterol metabolism Protein digestion and absorption PPAR signaling pathway Adipocytokine signaling pathway Amino sugar and nucleotide sugar metabolism Glycolysis / Gluconeogenesis Starch and sucrose metabolism Retinol metabolism C-vs-T34 1,105 964 2,069 Ribosome biogenesis in eukaryotes Rpp、UTP、
POP、REXO、
NOB、POLR、
RPI、HPSE、
Galns、LIPF、
TSPO、Tace、
NotchRNA polymerase RNA degradation Amino sugar and nucleotide sugar metabolism Arachidonic acid metabolism Glycosaminoglycan degradation Cytosolic DNA-sensing pathway Cholesterol metabolism Lysosome Notch signaling pathway 2.5 免疫基因表达量测定
试验虾在感染DIV1后72h的CAT、Cu/ZnSOD、CTL等免疫基因表达水平见图 7。结果显示, 感染DIV1的罗氏沼虾的免疫基因CAT、Cu/ZnSOD、CTL和ACP在温度32℃时, 其表达量显著高于其他温度。CAT、Cu/ZnSOD、CTL和ACP均在温度低于32℃或高于32℃时基因表达量降低, 在温度32℃时表达量明显升高。推测温度32℃时, 能够有效促进感染DIV1的罗氏沼虾体内的免疫基因表达量增加, 以此抵御病毒入侵。
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图 7 罗氏沼虾感染DIV1后免疫基因的表达水平**表示各组间有显著性差异(P<0.05)Figure 7. The expression levels of immune genes in M. rosenbergii after infection with DIV1* * means significant difference in groups (P<0.05)3. 讨论
3.1 温度对罗氏沼虾体内病毒复制的影响
十足目虹彩病毒1作为近些年来我国新出现的一种DNA病毒, 其传播速度快, 易感宿主范围广, 病毒检出率和致死率极高, 严重危害着我国虾类养殖业的经济发展, 迫切需要有效的应对措施[14—16]。温度是水产养殖中的重要影响因素, 适宜的温度不仅能够影响水产动物的生长代谢, 还会对病害的感染和爆发造成影响。多数病毒都是在一定的温度范围内才会迅速增殖、暴发, 在罗淑娅等[17]探究水温对白斑综合征病毒的影响中, 能够了解到病毒复制周期中的多个环节都会受到温度的影响, 例如病毒大分子合成所需的酶以及病毒脱壳等都与温度密切相关。还有研究表明[18]高温与加快感染病毒的虾类的细胞凋亡有关, 并且水温还会对宿主的抗病毒免疫反应产生影响。在本试验中, 罗氏沼虾感染DIV1的72h内病毒迅速增殖, 在28℃时病毒复制达到高峰期, 温度继续升高后病毒复制呈下降趋势, 当温度到达34℃时病毒复制降至最低, 这与郭晓萌等[7]的研究结果一致, 即当水温高于32℃时, 高温会抑制虾体内DIV1的复制, 推测水温升高会对病毒复制周期的过程产生影响, 导致病毒的入侵和增殖的能力受到阻碍, 同时高温还会影响罗氏沼虾机体的免疫反应, 增强宿主的抗病毒能力。
3.2 温度对罗氏沼虾关键调控通路的作用机制
虾主要依靠先天免疫系统来识别和抵抗病原入侵, 肝胰腺作为先天性免疫的关键器官, 在免疫防御、解毒、造血及各项生理代谢调节方面发挥着重要功能[19]。本研究主要通过对不同温度下感染D1V1 72h的罗氏沼虾进行转录组测序分析, 共鉴定出8483个差异表达基因, 这些差异表达基因主要富集在视黄醇代谢(Retinol metabolism)、花生四烯酸代谢(Arachidonic acid metabolism)、不饱和脂肪酸的生物合成(Biosynthesis of unsaturated fatty acids)、ɑ-亚油酸代谢(alpha-Linolenic acid metabolism)、氨基糖和核苷酸糖代谢(Amino sugar and nucleotide sugar metabolism)、糖酵解/糖异生(Glycolysis/Gluconeogenesis)、淀粉和蔗糖代谢(Starch and sucrose metabolism)、糖胺聚糖降解(Glycosaminoglycan degradation)等通路。这些通路主要与Warburg效应密切相关, Warburg效应最初是指肿瘤细胞或癌细胞通过有氧糖酵解反应, 逃避正常细胞凋亡并迅速增殖的行为, 后发现该效应在某些无脊椎动物中同样能够发生[20]。研究发现DIV1感染日本囊对虾后能够诱导Warburg效应, 通过削弱有氧呼吸, 进行高效糖酵解反应, 帮助病毒逃避细胞凋亡和宿主免疫, 并获得大量ATP促进病毒快速增殖、感染宿主细胞[8]。相关研究表明, 糖酵解的激活、脂质代谢的增加等代谢途径会帮助肿瘤细胞增殖、转移及免疫逃逸, 而在Warburg效应导致的免疫抑制环境影响下, 免疫细胞会通过其独特的代谢途径获能, 如巨噬细胞依赖于糖酵解代谢进行分化、脂肪酸和氨基酸代谢影响T细胞的增殖、分化及功能发挥[21]。在本研究中, DIV1感染罗氏沼虾后诱导产生了一系列代谢通路, 分析后发现这些通路均与宿主体内的Warburg效应相关, 推测这些通路可能是DIV1感染宿主的一种方式, 能够在感染后实现免疫逃逸、快速增殖。另一方面, 在Warburg效应造成的免疫抑制环境的影响下, 免疫细胞通过糖酵解、氨基酸及脂质代谢等途径获能, 并且根据温度能够通过影响机体代谢水平来间接调控病毒复制这一作用, 推测高温会促使机体内的代谢水平发生变化, 帮助免疫细胞更快获能, 激活机体免疫反应, 从而发挥抗病毒功能。
3.3 温度对罗氏沼虾关键基因的调控作用
本试验通过检测罗氏沼虾肝胰腺中免疫基因的表达水平, 以此来观察罗氏沼虾感染DIV1后体内的免疫反应。过氧化氢酶(CAT)和铜锌超氧化物歧化酶(Cu/ZnSOD)作为抵御ROS介导的氧化损伤的重要防御机制, 前者能够减少氧化应激反应[22, 23], 后者与甲壳类动物的免疫能力显示出良好的相关性[24]。本研究中CAT和Cu/ZnSOD在水温32℃时表达水平显著高于其他温度, 病毒感染后导致罗氏沼虾体内发生氧化应激反应, 而水温32℃可能促进机体产生了更多CAT和Cu/ZnSOD以此来抵御体内的氧化应激, 帮助调节体内氧化和抗氧化的动态平衡; C型凝集素(CTL)是一种重要的模式识别受体, 通过病原体相关分子模式(Pathogen-associated molecular pattern, PAMP)来抵抗病原入侵, 从而在先天性免疫中发挥重要作用[25—27]。本研究中C型凝集素在水温32℃时表达水平显著高于其他温度, 推测水温32℃可能促进了罗氏沼虾体内的C型凝集素更快地释放信号, 激活机体的先天性免疫, 加快清除入侵的病原体; 酸性磷酸酶(ACP)是溶酶体系统的重要组成部分, 参与DNA合成、蛋白质分泌与脂代谢等生理代谢活动, 也是动物体内重要的解毒体系, 在虾类免疫防御中发挥着积极作用[28, 29]。本研究中酸性磷酸酶在水温32℃时表达水平显著高于其他温度, 推测在温度32℃影响下, ACP表达上调, 积极参与调节机体代谢和信号传导等过程, 同时还参与识别、吞噬和降解入侵的病原体, 在罗氏沼虾机体免疫防护中发挥着重要作用。本试验中免疫基因CAT、Cu/ZnSOD、CTL、ACP的表达水平在水温32℃时显著高于其他温度, 推测温度32℃时罗氏沼虾机体会通过增强抗氧化能力、激活机体先天性免疫等方式, 以此来抵御病毒入侵。
综上所述, 本研究探究了温度对罗氏沼虾感染虹彩病毒的影响, 发现当水温34℃时, 罗氏沼虾的存活率增加、存活时间延长, 且病毒的复制被抑制; 结合转录组分析揭示了DIV1可能通过诱导Warburg效应, 实现免疫逃逸, 从而快速增殖、感染宿主的分子机制, 并且病毒感染罗氏沼虾后还会影响其体内的代谢水平发生变化; 通过分析免疫相关基因的表达量变化, 发现适当提高水温能够激活罗氏沼虾的先天性免疫。本研究初步揭示了温度作为养殖重要因素, 对水产动物抵抗病毒侵染的影响, 探究了温度影响下罗氏沼虾对DIV1的免疫调控机制, 并筛选出了关键的信号通路和免疫相关基因, 为进一步阐明DIV1的感染机制、罗氏沼虾的抗病毒免疫机制和开发相关病毒防控产品提供了参考依据。
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