微卫星标记对中国引进加州鲈养殖群体遗传多样性的分析
GENETIC ANALYSIS FOR CULTURED LARGEMOUTH BASS (M ICRO PTERUS SALMO ID ES) IN CHINA WITHM ICROSATELLITES
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摘要: 为了解我国引进加州鲈养殖群体的种群遗传结构和种质资源现状,本文发展了加州鲈的微卫星标记。用磁珠富集法获得加州鲈微卫星标记267个,设计并合成了85对微卫星引物对加州鲈的基因组进行遗传多样性分析,从中筛选出18对并从网上查询获得3对共21对引物对加州鲈的基因组DNA进行扩增。PCR扩增产物在8%的聚丙烯酰胺凝胶中分离,硝酸银染色,经紫外成像后对电泳条带进行统计分析。计算得到三个群体的平均等位基因数分别为2.3、2.3和2.1;多态信息含量(PIC)为0.0906-0.7480;平均杂合度观测值分别为0.384、0.396和0.356;杂合度期望值为0.375、0.403和0.368。统计结果初步表明3个不同群体平均杂合度处于中等偏低水平,遗传多样性不高。Abstract: The Largemouth bass (M icropterus salmoides) , native in the North America,was introduced into China in.980 sand is becoming an important freshwater cultured fish with more than.00, 000 tons of p roduction annually in China.Formore than 0 years of aquaculture, the germp lasm quality and genetic diversitymay have declined due to neglecting to inspect the genetic diversity in Largemouth bass and the lack of the longrun and effective administer. In order to aid in investigation of the population genetic structure and marker assisted breeding,microsatellite enrichment by magnetic beadswas used to isolating molecular genetic markers.The genomic DNA was cut by the enzyme of Sau3A I, and targeted segments were collected with the size of 400-900 base pairs by centrifugation of sucrose density gradient.Then the segmentswere purified in a low melting agarose gel and ligated with a short linkers(0bp) , from which, the“genetic PCR library”was created.These genomic DNA fragments were hybridized with a biotinlabeled SRS (simp le repeat sequence) p robe(CA).5.The hybrid mixture was incubated with magnetic beads coated with strep tavidin.Afterwashing to remove the nonSRS fragments, the eluted singlestranded DNA contained the selected microsatellite DNA.The selected DNAswere amp lified using p rimers designed comp lementary to the tinkers, cloned into the pMD.8T vector and transformed into competentE.coli DH5a.As a result, 67 microsatelliteswere obtained and 85 microsatellite p rimerswere designed by software Primer3.0, and.8 loci showed polymorphism. In addition, 3 pairs of microsatellite p rimers were obtained from nucleotide websites.The. polymorphic lociwere used to estimate genetic diversity and genetic differentiation in 3 culture populations ofLargemouth bass, three of which were collected from Guangzhou (G,n=30) ,Daliang (D,n=8) and Nanshui (N,n=30).Genome DNA was extracted from 88 samp les for the three culture populations.Each fish as extracted from blood andthe PCR was performed in a 5 L reaction and isolated by electrophoresis on 8% polyacrylamide gel and visualized by silver staining.The data were calculated and analyzed by statistic method.The results indicated that: the number of genotypes per locus ranged from to 3,with allele size ranging from.7 bpto 397 bp; the highest numbers of alleleswere from locus JZL3, JZL68, JZL83, JZL84, JZL85 and Lma. (3) followed bythe others were only acquired alleles.The mean effective number of three culture populations from Guangzhou, Daliangand Nanshui were..67,..75 and..67, respectively.Polymorphism information content value (PIC) wasmore than 0.5 in locus JZL3, JZL85 and Lma.; the PIC valuewasmore than 0.5 and less than 0.5 in locus JZL3, JZL36, JZL37, JZL43, JZL48, JZL53, JZL59, JZL60, JZL68, JZL7,JZL83, JZL84 and Lar7; the PIC value was less than 0.5 in locus JZL., JZL40, JZL67, JZL7. andMdo7.The observed heterozygosity (Ho) and the expected heterozygosity (He) were calculated based on frequencies of genotypes and alleles of each microsatellite locus, the average Ho value was the highest with Daliang (Ho=0.396,He= 0.403)and followed by Guangzhou (Ho=0.384, He=0.375) and Nanshui (Ho=0.356,He=0.368).The genetic departure index( d value) was ranged from -0.763 to 0.47 d value of JZL67 which in Daliang population was -0.763, obviously, on thelow side, JZL3. in Nanshui population was 0.47 on the high side, it showed the loci JZL67 deviated from the equilibrium inDaliang population for heterozyosis deficiency and JZL3. in Nanshui population for heterozyosis excess.All of these indices indicated that the cultured populations of Largemouth bass in Guangdong Province have relativelylow genetic diversity, and inbreeding has occurred.The reasons may result from inbreeding while artificial p ropagation, andneglecting the genetic diversities and population quantity while introduced into China.The methods for prevention of Largemouth bass germplasm degeneration are also suggested.
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Keywords:
- Largemouth bass /
- Microsatellite /
- Genetic diversity /
- DNA
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中国是全球水产养殖业产量最为庞大的国家, 优质的水产饲料供应是确保该行业持续健康发展的关键因素[1]。在现代水产养殖中, 豆粕作为水产动物饲料原料的重要来源, 因蛋白含量高和品质较稳定等优点使其成为水产动物饲料配方中较为常用的植物蛋白源[2]。但由于豆粕存在胰蛋白酶抑制剂和大豆相关抗原等抗营养因子[3, 4], 限制了其在水产饲料领域的应用[5]。且我国大豆多依赖进口, 这成为豆粕供应紧张、价格波动剧烈的根本因素。豆粕减量替代工作对提高水产养殖业经济效益、保护生态环境有重要意义。使用其他蛋白源替代豆粕, 可以一定程度上缓解豆粕紧缺的压力, 从而减少豆粕的消费和进口量[6]。
玉米酒精糟全称为玉米干酒糟及其可溶物(玉米DDGS), 是燃料乙醇生产过程中的重要副产物之一[7]。玉米DDGS富含蛋白质、脂肪、纤维素和维生素, 具有营养丰富、产量高、成本低以及来源广等优势, 在水产及畜禽配合饲料中通常用来替代豆粕和鱼粉, 是优质的蛋白质和能量来源[8—10]。此外, 玉米DDGS有较好的适口性和黏结性, 在水产饲料加工过程中颗粒成型率高, 用量可达10%—20%[11]。饲料中添加不同水平(3%、6%和12%)的玉米DDGS替代部分豆粕对斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)的存活率、增重率和特定生长率等生长性能指标无显著影响, 但添加6%和12%的玉米DDGS均会显著降低斑点叉尾鮰体侧皮肤亮度, 同时增加其体色和肉色的黄度[12]。饲料中添加15%的玉米DDGS可提高金头鲷(Sparus aurata)的肝脏抗氧化能力, 降低氧化应激对机体的损伤, 而添加35%的玉米DDGS则降低其肝脏抗氧化酶活性, 导致机体氧化应激[13]。在欧洲鲶(Silurus glanis)饲料中添加20%和30%玉米DDGS其肝组织形态与对照组相比更健康[14]。
中华圆田螺(Cipangopaludina cathayensis)俗称田螺或者螺蛳, 隶属于软体动物门(Phylum Mollusca)、腹足纲(Gastropoda)、田螺科(Viviparidae)及圆田螺属(Cipangopahudina Hannibal)[15]。中华圆田螺具备较强的环境适应能力, 其生长的最佳温度范围为20—28℃[16]。养殖户在中华圆田螺的养殖过程中主要以投喂菜叶、动物组织、豆粕、鱼粉等常规饲料原料为主[17]。中华圆田螺的生长与饵料息息相关, 单靠天然饵料或单一原料养殖, 其养殖经济效益难有大幅提升[18]。但目前鲜有关于中华圆田螺人工配合饲料的研究。本实验研究不同水平玉米DDGS替代豆粕蛋白对中华圆田螺幼螺生长性能、抗氧化能力和消化系统组织学的影响, 为中华圆田螺配合饲料中添加适宜比例的玉米DDGS提供理论依据, 促进中华圆田螺养殖业的可持续发展。
1. 材料与方法
1.1 实验饲料与实验分组
本实验所采用的饲料配方及其常规化学成分如表 1所示, 氨基酸组成如表 2所示。通过在基础饲料中以不同比例玉米DDGS替代豆粕蛋白[0 (D0)、25% (D25)、50% (D50)和75% (D75)], 制备4种等氮等能饲料, 其DDGS含量分别为0、13.63%、27.26%及40.89%。饲料原料购自福建大昌生物科技实业有限公司。所有饲料原料粉碎后过40目筛, 依照配方比例从小到大的顺序逐一添加并混合均匀, 用制粒机(SLP-45, 上海华夏渔业机械仪器工贸公司)制成粒径3 mm的饲料, 经60℃烘干后冷却密封, 置于–20℃冰箱备用。
表 1 实验基础饲料配方及化学组成(%干物质)Table 1. Diet formulation and chemical composition of experimental diets (% in dry matter)原料
Ingredient替代水平
Replacing level (%)0 (D0) 25% (D25) 50% (D50) 75% (D75) 鱼粉Fish meal1 3.50 3.50 3.50 3.50 大豆粕Soybean meal2 32.00 24.00 16.00 8.00 玉米酒精糟Corn DDGS4 0 13.63 27.26 40.89 菜粕Rapeseed meal3 8.00 8.00 8.00 8.00 面粉Flour4 5.00 5.00 5.00 5.00 玉米淀粉Corn starch4 30.00 23.10 16.23 9.38 微晶纤维素
Microcrystalline cellulose42.40 3.83 5.63 7.41 鱼油Fish oil4 0.80 0.75 0.56 0.37 大豆油Soybean oil4 1.60 1.49 1.12 0.75 鸡肉粉Chicken meal4 3.50 3.50 3.50 3.50 磷酸二氢钙CaH2PO44 1.00 1.00 1.00 1.00 氯化胆碱Choline chloride4 0.20 0.20 0.20 0.20 1%预混料Premix4 1.00 1.00 1.00 1.00 羧甲基纤维素
Carboxymethyl cellulose41.00 1.00 1.00 1.00 膨润土Bentonite4 10.00 10.00 10.00 10.00 饲料化学成分
Chemical composition
(% in dry matter)粗蛋白Crude protein 22.72 23.47 22.71 22.35 粗脂肪Crude lipid 5.28 5.09 5.18 5.69 能量Gross energy
(kJ/g in dry matter)14.07 14.69 13.92 14.28 注: 1由秘鲁塔萨鱼制品有限公司提供。2由福建康宏股份有限公司提供。3由益海(防城港)大豆工业有限公司提供。4由福建大昌生物科技实业有限公司提供。鱼粉、大豆粕、玉米酒精糟、菜粕和鸡肉粉的粗蛋白含量分别为67.89%、46.02%、27.07%、38.61%和55.24%。鱼粉、大豆粕、玉米酒精糟、菜粕和鸡肉粉的粗脂肪含量分别为8.89%、1.87%、5.18%、1.40%和14.98%Note: 1Provided by TASA Fish Product Co., Ltd., Peru. 2Provided by Fujian Kanghong CO., Ltd., China. 3Provided by Yihai (Fangchenggang) Soybean Industry CO., Ltd., China. 4Provided by Fujian Dachang Biotechnology Industry CO., Ltd., China. The protein contents of fish meal, soybean meal, corn DDGS, rapeseed meal, and chicken meal were 67.89%, 46.02%, 27.07%, 38.61%, and 55.24%. The crude lipid contents of fish meal, soybean meal, corn DDGS, rapeseed meal, fish oil, soybean oil, and chicken meal were 8.89%, 1.87%, 5.18%, 1.40% and 14.98% 表 2 实验饲料氨基酸组成Table 2. Amino acid composition of experimental diets (% in dry matter)氨基酸Amino acid 替代水平Replacing level (%) 0 (D0) 25% (D25) 50% (D50) 75% (D75) 必需氨基酸
Essential amino acid苏氨酸Thr 0.96 0.88 0.79 0.71 组氨酸His 0.54 0.45 0.43 0.39 赖氨酸Lys 1.35 1.16 0.98 0.80 缬氨酸Val 1.16 1.08 0.99 0.90 蛋氨酸Met 0.27 0.32 0.35 0.38 异亮氨酸Ile 0.97 0.90 0.76 0.65 亮氨酸Leu 1.72 1.61 1.44 1.31 苯丙氨酸Phe 1.12 1.00 0.85 0.71 精氨酸Arg 1.51 1.36 1.11 0.94 非必需氨基酸
Nonessential amino acid天冬氨酸Asp 2.34 2.03 1.69 1.37 酪氨酸Tyr 0.71 0.64 0.51 0.42 丝氨酸Ser 1.19 1.09 0.97 0.86 谷氨酸Glu 4.28 3.87 3.38 2.94 甘氨酸Gly 1.18 1.27 1.25 1.19 丙氨酸Ala 0.82 1.09 1.06 1.02 胱氨酸Cys 0.16 0.19 0.19 0.17 脯氨酸Pro 1.05 1.00 0.99 0.98 总氨基酸
Total amino acids21.33 19.94 17.74 15.74 1.2 实验动物与养殖管理
中华圆田螺幼螺购自武夷山市田螺湾生态农业有限公司。选择外观完整、摄食正常、体质健康的中华圆田螺幼螺1140只随机投放至12个网箱中, 每个网箱中95只。本实验共4个实验组, 每组3个平行。实验期间, 每日定时投喂2次饲料(7:30和17:30)并记录摄食量。每日观察是否有幼螺死亡情况, 记录死螺数量并捞出, 实验一共持续56d。在福建建瓯稻渔科技小院提供的稻田中设置网箱(1.2 m×0.7 m×0.7 m), 每个网箱间隔30 cm, 保持网箱内水深20 cm左右, 用竹竿固定于稻田中。水源由本地溪水经水管引入, 水质稳定, 水流畅通。每天检测2次(7:30和17:30)气温和水温, 每2周检测水中DO值及氨氮含量。在整个养殖过程中, 养殖水体水温25—28℃, 溶解氧含量≥6 mg/L, 氨氮含量<0.2 mg/L。
1.3 实验取样
在养殖实验结束后, 禁食24h, 对实验螺进行捞取并进行数量统计与称重, 用于统计存活率、饲料效率、增重率。从每个重复中随机取7只螺, 去壳后冻存在–20℃冰箱中用于体成分分析。此外, 另取3只螺进行体重及肉重的称量, 以计算出肉率; 对其肝胰腺与肠道进行解剖, 称量肝胰腺的重量以求得肝体比, 并采用中性甲醛对肝胰腺和中肠组织进行固定, 随后进行HE染色以制备组织切片。另选取6只螺, 对其肝胰腺和肠道进行解剖, 放置于冻存管中, 经液氮急冻, 转移至–80℃的冰箱中保存, 以备后续酶活性和基因表达测定。
1.4 样品的测定
对实验用饲料及实验螺螺体水分、粗蛋白、粗脂肪及灰分含量进行了测定。样品在105℃烘干至恒重并粉碎, 水分按照干燥法测定[19]。粗蛋白用凯氏定氮仪(Kjeltec8400, FOSS)测定[20]。粗脂肪用索氏抽提仪(ST243, FOSS)测定[21]。样品置于马弗炉(SX2-2.5-10NP, 一恒)中, 550℃高温下焚烧3h, 以失重法来测定灰分含量[22]。
肝胰腺及肠道内的消化酶如胰蛋白酶(TPS)、脂肪酶(LPS)和淀粉酶(AMS), 抗氧化和免疫相关酶如碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、谷丙转氨酶(GPT)、天门冬氨酸氨基转移酶(GOT)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽S转移酶(GST)活性及丙二醛(MDA)含量的测定均使用南京建成生物工程研究所的试剂盒, 测定方法按照说明书进行。
从螺的肝胰腺及肠道样本提取总RNA。使用超痕量核酸蛋白测定仪(Scandrop100, Analytik Jena, Germany)评估提取的RNA浓度, 按A260/A280进行计算[23]。逆转录步骤使用逆转录试剂盒进行。qPCR反应在荧光定量PCR仪(Analytickjenaq-tower 2.2, Germany)中进行。qPCR反应体系的组成包括9 μL的cDNA模板, 10 μL SYBR Green Realtime PCR Master Mix, 以及10 μmol/L正向和反向定量引物各0.5 μL。应用以下程序: 95℃ 15s, 60℃ 1min, 共进行40个循环。设置内参基因β-actin, 根据2–∆∆Ct方程计算肝胰腺和肠道中基因的相对表达量[24]。本实验中所使用的基因扩增引物序列如表 3所示。
表 3 本实验所用引物Table 3. Primer pairs used for RT-qPCR analysis of related genes in this study基因名称
Gene name引物序列
Primer sequence (5′—3′)溶解温度
Tm (℃)基因库编号
GenBank numberβ-actin CGTCGCACTTCATGATGGAG
AGAAATTGTGCTACGTCGCC60 K05692 GPx TGGACAACAAGAACCAAAGTCA
TCCAACTAGTTTCACTTCCGGA60 K00432 GST TGGGCGCTTTTCTAGTCTCT
GAACTTGAGCGTTGGGAAGG60 K00799 SOD CTAAACGACCGCCAGCATTT
GCAATATTGTGGCAGGGGAG60 K04565 1.5 数据处理
计算公式:
存活率(SR, %)=100×Nt/N0;
摄食率(FR, %BW/d)=100×[F/(Wt+W0)t];
特定生长率(SGR, %/d)=100×(LnWt–LnW0)/t;
增重率(WGR, %)=100×(Wt−W0)/W0;
饲料效率(FE, %)=100×(Wt–W0)/F;
蛋白质效率(PER)=(Wt–W0)/F×P;
肝体比(HSI)=100×(Wz/W);
出肉率(FY, %)=100×(Wf/W)。
式中, N0表示实验起始时实验螺的数量, Nt表示实验结束后存活的实验螺数量, W0代表平均初始体重(g), Wt则为平均终末体重(g), t为实验持续时间(天), F表示饲料干重摄入量(g), P代表饲料粗蛋白含量(%), W表示螺体的质量(g), Wz为肝脏胰腺的质量(g), Wf为去壳后螺肉的质量(g)。实验数据以平均值±标准误(mean±SE)表示, 用SPSS 20.0对数据进行统计分析。通过一元方差分析(One-way ANOVA)分析实验结果, 用Duncan’s进行多重比较, P<0.05表示差异显著。
2. 结果
2.1 玉米DDGS替代豆粕蛋白对中华圆田螺幼螺生长性能的影响
如表 4所示, 用不同水平玉米DDGS替代豆粕蛋白, 各组中华圆田螺幼螺的存活率和摄食率无显著差异(P>0.05)。与D0组相比, D25组中华圆田螺幼螺的平均终末体重、增重率和特定生长率显著升高(P<0.05), D50和D75组中华圆田螺幼螺的平均终末体重、增重率和特定生长率显著降低(P<0.05)。D25组中华圆田螺幼螺的饲料效率最高且显著高于D50和D75组(P<0.05)。D25组中华圆田螺幼螺蛋白质效率比与D0组无显著差异(P>0.05), 但显著高于D50和D75组(P<0.05)。当玉米DDGS替代比例≤50%时, 中华圆田螺幼螺的肝体比和D0组相比无显著差异(P>0.05), D75组中华圆田螺幼螺的肝体比显著低于D0组(P<0.05)。D25组和D50组中华圆田螺幼螺的出肉率和D0组相比无显著差异(P>0.05), D75组中华圆田螺幼螺的出肉率显著低于D0组(P<0.05)。
表 4 玉米DDGS替代豆粕蛋白对中华圆田螺幼螺生长性能的影响(平均值±标准误)*Table 4. Effects of replacing soybean meal protein with corn DDGS on the growth performance of juvenile C. cathayensis (mean±SE) *指标Index 替代水平Replacing level (%) 0 25 50 75 初始体重
IBW (g)3.60±0.01 3.60±0.01 3.60±0.02 3.60±0.01 终末体重
FBW (g)5.43±0.06b 5.77±0.09a 5.07±0.10c 4.87±0.09c 存活率
SR (%)80.67±5.36 74.67±6.36 83.67±8.95 76.33±1.45 摄食率
FR (%BW/d)1.07±0.07 1.11±0.05 1.08±0.04 0.97±0.03 特定生长率
SGR (%/d)0.74±0.02b 0.84±0.03a 0.61±0.04c 0.54±0.03c 增重率
WGR (%)51.09±1.72b 60.34±2.48a 40.63±2.76c 35.16±2.54c 饲料效率
FE (%)68.94±6.73ab 74.91±4.13a 55.50±2.29b 55.03±2.23b 蛋白质效率
PER3.03±0.30ab 3.19±0.18a 2.48±0.10b 2.42±0.10b 肝体比HSI 2.85±0.04a 2.92±0.09a 2.65±0.12ab 2.46±0.10b 出肉率
FY (%)46.11±1.33ab 48.65±1.24a 42.60±0.80bc 41.54±1.57c 注: *同列数据后面英文字母不同者表示各组之间差异显著(P<0.05); 下同Note: *Different superscript letters within each column represent significant differences (P<0.05); The same applies below 2.2 玉米DDGS替代豆粕蛋白对中华圆田螺幼螺体成分的影响
如表 5所示, D25组中华圆田螺幼螺螺体水分与D0组无显著差异(P>0.05), 但显著低于D50和D75组(P<0.05), 当玉米DDGS替代比例≥50%时, 中华圆田螺幼螺的水分与D0组相比无显著差异(P>0.05)。与D0组相比, D25组中华圆田螺幼螺的粗蛋白、粗脂肪和灰分均显著升高(P<0.05), 当玉米DDGS替代比例≥50%时, 中华圆田螺幼螺的粗蛋白、粗脂肪和灰分与D0组相比均无显著差异(P>0.05)。
表 5 玉米DDGS替代豆粕蛋白对中华圆田螺幼螺体成分的影响(平均值±标准误)Table 5. Effects of replacing soybean meal protein with corn DDGS on body composition of juvenile C. cathayensis (mean±SE)指标Index 替代水平Replacing level (%) 0 25 50 75 水分
Moisture (%)83.86±
0.51ab82.03±
0.64b84.89±
0.31a84.56±
0.78a粗蛋白
Crude protein (%)10.25±
0.07b11.21±
0.29a10.05±
0.40b9.93±
0.25b粗脂肪
Crude lipid (%)0.56±
0.03b0.68±
0.02a0.48±
0.01b0.50±
0.04b灰分Ash (%) 2.30±
0.28b3.85±
0.06a2.57±
0.35b2.46±
0.43b2.3 玉米DDGS替代豆粕蛋白对中华圆田螺幼螺消化酶活性的影响
如表 6所示, D25组中华圆田螺幼螺肝胰腺和肠道的胰蛋白酶及脂肪酶活性与D0组无显著差异(P>0.05)。玉米DDGS的替代水平≥50%时, 中华圆田螺幼螺肝胰腺和肠道胰蛋白酶、脂肪酶活性显著降低(P<0.05)。饲料中玉米DDGS替代比例≤75%时, 对中华圆田螺幼螺的肝胰腺及肠道淀粉酶的活性无显著影响(P>0.05)。
表 6 玉米DDGS替代豆粕蛋白对中华圆田螺幼螺消化酶活性的影响(平均值±标准误)Table 6. Effects of replacing soybean meal protein with corn DDGS on the digestive enzyme of juvenile C. cathayensis (mean±SE)指标Index 替代水平Replacing level (%) 0 25 50 75 肝胰腺胰蛋白酶Hepatopancreatic trypsin (U/mg prot) 167.92±1.21a 178.09±5.07a 126.14±6.50b 114.84±3.32b 肝胰腺脂肪酶Hepatopancreatic lipase (U/g prot) 2.55±0.19a 2.54±0.18a 1.83±0.17b 1.89±0.18b 肝胰腺淀粉酶Hepatopancreatic amylase (U/mg prot) 3.11±0.22 2.43±0.18 2.76±0.46 2.52±0.16 肠道胰蛋白酶Intestinal trypsin (U/mg prot) 143.12±6.96a 143.78±4.76a 125.14±2.15b 113.51±2.82b 肠道脂肪酶Intestinal lipase (U/g prot) 1.69±0.09a 1.54±0.13a 1.07±0.13b 1.11±0.12b 肠道淀粉酶Intestinal amylase (U/mg prot) 3.19±0.22 2.47±0.08 2.50±0.83 1.96±0.57 2.4 玉米DDGS替代豆粕蛋白对中华圆田螺幼螺肝胰腺抗氧化及免疫指标的影响
如表 7所示, D25组中华圆田螺幼螺肝胰腺AKP、ACP、GPT、GOT、CAT、SOD、GPx、GST酶活性及MDA含量和D0组相较均无显著差异(P>0.05)。与D0组相比, 玉米DDGS替代水平≥50%时, 中华圆田螺幼螺肝胰腺AKP和ACP活性显著升高(P<0.05)。D75组中华圆田螺幼螺肝胰腺GPT和GOT活性与D0相比显著上升(P<0.05)。当玉米DDGS替代比例≥50%时, 中华圆田螺幼螺肝胰腺CAT、SOD和GPx活性均显著下降(P<0.05)。D50组中华圆田螺幼螺肝胰腺GST活性比D0组显著降低(P<0.05)。D75组中华圆田螺幼螺肝胰腺MDA含量显著高于其他3组(P<0.05)。
表 7 玉米DDGS替代豆粕蛋白对中华圆田螺幼螺肝胰腺抗氧化及免疫指标的影响(平均值±标准误)Table 7. Effects of replacing soybean meal protein with corn DDGS on the antioxidant and immune indexes in the hepatopancreas of juvenile C. cathayensis (mean±SE)指标Index 替代水平Replacing level (%) 0 25 50 75 碱性磷酸酶AKP(金氏单位/g prot) 56.53±0.54b 52.55±1.66b 68.27±2.69a 69.99±2.80a 酸性磷酸酶ACP(U/g prot) 555.11±17.90b 536.96±12.00b 620.72±9.66a 659.71±10.62a 天门冬氨酸氨基转移酶GPT (U/g prot) 56.49±1.38b 52.44±1.22b 55.03±1.45b 62.25±1.24a 谷丙转氨酶GOT(U/g prot) 47.20±4.06b 54.97±3.04ab 53.39±1.00ab 58.42±1.20a 过氧化氢酶CAT(U/mg prot) 50.87±1.58a 46.30±2.69a 37.37±2.31b 38.63±1.87b 超氧化物歧化酶SOD(U/mg prot) 212.80±6.85a 210.74±6.85a 116.05±8.46b 125.32±7.92b 谷胱甘肽过氧化物酶GPx(U/mg prot) 65.03±2.75a 61.95±2.54ab 57.41±1.38b 45.42±2.14c 谷胱甘肽S转移酶GST(U/mg prot) 310.86±4.09a 271.81±24.48ab 236.22±15.55b 260.98±17.04ab 丙二醛MDA(nmol/mg prot) 1.08±0.14b 1.06±0.16b 1.09±0.22b 1.69±0.02a 2.5 玉米DDGS替代豆粕蛋白对中华圆田螺幼螺肠道抗氧化及免疫指标的影响
如表 8所示, D25组中华圆田螺幼螺肠道AKP、ACP、CAT、SOD、GPx、GST酶活性和MDA含量与D0组均无显著差异(P>0.05)。和D0组相较, D75组中华圆田螺幼螺肠道AKP和ACP活性显著升高(P<0.05)。当玉米DDGS替代比例≥50%时, 中华圆田螺幼螺肠道CAT、SOD、GPx和GST活性显著降低(P<0.05), 肠道MDA含量显著提高(P<0.05)。
表 8 玉米DDGS替代豆粕蛋白对中华圆田螺幼螺肠道抗氧化及免疫指标的影响(平均值±标准误)Table 8. Effects of replacing soybean meal protein with corn DDGS on the antioxidant and immune indexes in the intestine of juvenile C. cathayensis (mean±SE)指标Index 替代水平Replacing level (%) 0 25 50 75 碱性磷酸酶AKP(金氏单位/g prot) 89.25±9.90b 94.85±5.89b 103.85±4.63ab 126.18±5.20a 酸性磷酸酶ACP(U/g prot) 61.69±0.93b 60.32±1.04b 57.77±0.50b 67.57±2.06a 过氧化氢酶CAT(U/mg prot) 25.40±4.91a 20.24±2.58ab 14.46±0.60b 13.14±0.20b 超氧化物歧化酶SOD(U/mg prot) 187.43±5.28a 178.56±6.58a 139.22±10.26b 140.42±14.05b 谷胱甘肽过氧化物酶GPx(U/mg prot) 87.81±1.14a 86.57±0.54a 78.84±2.42b 74.74±2.73b 谷胱甘肽S转移酶GST(U/mg prot) 623.72±13.79a 635.79±25.49a 560.80±6.26b 549.66±6.56b 丙二醛MDA(nmol/mg prot) 0.60±0.00c 0.64±0.02bc 0.70±0.02ab 0.73±0.03a 2.6 玉米DDGS替代豆粕蛋白对中华圆田螺幼螺肝胰腺和肠道组织学的影响
如图 1所示, D0组和D25组中华圆田螺幼螺的肝胰腺组织结构完整, 肝小管的界限清晰, 管腔形态正常, 肝细胞的大小和形态均一。D50组部分肝小管排列松散。D75组部分肝小管管腔缩小、结构紊乱, 部分基膜出现溶解现象。
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图 1 玉米DDGS替代豆粕蛋白对中华圆田螺幼螺肝胰腺组织学的影响(HE染色, 200×)a. 消化细胞; b. 肝小管萎缩; 红色箭头. 管腔缩小Figure 1. Effects of replacing soybean meal protein with corn DDGS on hepatopancreas histology of juvenile C. cathayensis (HE staining, 200×)a. Digestive cell; b. Hepatic tubule atrophy; Red arrow. Lumen of hepatic tubules narrow如图 2所示, D0组中华圆田螺幼螺的肠道组织结构呈现出良好的完整性, 上皮细胞排列紧凑且固有层结构紧实。D25组与D0组的组织结构相似, 未发现明显的病理变化, 结构完整, 肠微绒毛清晰可见。D50组上皮细胞排列松散。D75组杯状细胞减少, 固有层萎缩, 上皮细胞排列松散和空泡化程度加深。
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图 2 玉米DDGS替代豆粕蛋白对中华圆田螺幼螺中肠组织学的影响(HE染色, 400×)a. 上皮细胞; b. 微绒毛; d. 固有层Figure 2. Effects of replacing soybean meal protein with corn DDGS on midgut histology of juvenile C. cathayensis (HE staining, 400×)a. Epithelial cell; b. Microvillus; d. Lamina propria2.7 玉米DDGS替代豆粕蛋白对中华圆田螺幼螺肝胰腺和肠道抗氧化相关基因表达的影响
如图 3所示, D25组中华圆田螺幼螺肝胰腺的GPx、GST和SOD基因的表达水平与D0组无显著差异(P>0.05)。然而, 当玉米DDGS的替代比例≥50%时, 中华圆田螺幼螺肝胰腺中GPx、GST和SOD基因的表达水平显著低于D0组(P<0.05)。
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图 3 玉米DDGS替代豆粕蛋白对中华圆田螺幼螺肝胰腺基因表达的影响Figure 3. Effects of replacing soybean meal with corn DDGS on gene expression in hepatopancreas of juvenile C. cathayensis如图 4所示, D25组中华圆田螺幼螺的肠道GPx和GST基因表达水平与D0组无显著差异(P>0.05)。D50组GST基因表达水平显著低于D0组(P<0.05)。当玉米DDGS的替代比例为75%时, 中华圆田螺幼螺肠道的GPx和GST基因的表达水平显著低于D0组(P<0.05)。各组间中华圆田螺幼螺肠道的SOD基因表达水平无显著差异(P>0.05)。
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图 4 玉米DDGS替代豆粕蛋白对中华圆田螺幼螺肠道基因表达的影响Figure 4. Effects of replacing soybean meal protein with corn DDGS on gene expression in intestine of juvenile C. cathayensis3. 讨论
3.1 玉米DDGS替代豆粕蛋白对中华圆田螺幼螺生长性能的影响
玉米DDGS可作为替代蛋白源添加到部分水产动物的饲料中[12, 13]。用玉米DDGS替代25%和50%的鱼粉饲喂苏氏圆腹(((鱼芒)))(Pangasianodon hypophthalmus)对其存活率无显著影响[25]。饲料中玉米DDGS替代部分豆粕对奥尼罗非鱼(Oreochromis niloticus ♀ × Oreochromis aureus ♂)[26]和草鱼(Ctenopharyngodon idellus)[27]的存活率无显著影响。此外, 玉米DDGS替代豆粕不会影响南美白对虾(Litopenaeus vannamei)的摄食量[28]。本实验结果与上述结果相似, 玉米DDGS替代部分豆粕对中华圆田螺幼螺存活率和摄食率均无显著影响。随着饲料中玉米DDGS替代豆粕比例的增加, 奥尼罗非鱼的增重率和特定生长率呈现出先上升后下降的趋势[26]。当玉米DDGS替代豆粕比例≥20%, 草鱼的终末体重、增重率和特定生长率均显著降低[27]。饲料中玉米DDGS替代60%豆粕会导致尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus L.)终末体重、增重率和饲料效率显著降低[29]。在尼罗罗非鱼幼鱼饲料中玉米DDGS替代20%玉米粉和豆粕不会对增重率和饲料效率产生影响, 但40%DDGS组幼鱼的增重率和饲料效率显著降低[30]。出肉率通常作为衡量水产品生长性能和肉质品质的重要指标, 水产品的种类、生长阶段、生活环境等因素均可影响出肉率[31]。当饲料中双低菜粕的添加比例达到或超过75%时, 克氏原螯虾幼虾的出肉率显著降低[32]。在本实验中, 用玉米DDGS替代25%豆粕蛋白可提高中华圆田螺幼螺的生长性能, 这可能与玉米DDGS中的促生长因子有关[8—10]。D50和D75组中华圆田螺幼螺生长和饲料利用降低, D75组中华圆田螺幼螺的出肉率显著低于D0组, 可能是高水平玉米DDGS饲料中赖氨酸缺乏导致的[30, 33], 赖氨酸缺乏影响了肌肉细胞的生长和增殖[34]。作为一种重要的必需氨基酸, 赖氨酸的缺乏可能是饲料中玉米DDGS作为饲料蛋白源的限制因素之一[29]。此外, 玉米DDGS中较高的粗纤维含量也会影响中华圆田螺幼螺对营养物质的消化吸收, 从而降低生长性能[35]。
3.2 玉米DDGS替代豆粕蛋白对中华圆田螺幼螺体成分的影响
养殖动物的体成分受饲料营养组成的影响, 常被用作评价配合饲料优劣的一个指标[36]。动物能够有效地消化吸收饲料中的优质蛋白, 利用其促进机体生长和组织再生[37]。用玉米DDGS替代40%豆粕会显著降低尼罗罗非鱼鱼体蛋白质含量[30]。饲料中玉米DDGS替代15%和35%的豆粕对金头鲷全鱼粗蛋白、粗脂肪及灰分含量无显著影响[13]。在大菱鲆(Scophthalmus maximus)幼鱼的实验中, 玉米DDGS替代25%的鱼粉对全鱼干物质、粗蛋白和灰分含量没有显著影响[38]。珍珠龙胆石斑鱼(Epinephelus fuscoguttatus ♀ × Epinephelus lanceolatus ♂)幼鱼的研究结果显示, 用玉米DDGS替代饲料中33.33%以下的鱼粉对其全鱼水分、粗蛋白和粗灰分没有显著影响, 但显著提高了粗脂肪含量[39]。当大米干全酒精糟替代40%豆粕时, 罗非鱼鱼体粗灰分含量显著高于对照组, 原因可能是大米干全酒精糟在发酵过程中植酸被分解, 进而提高了磷的生物可利用程度[40, 41]。在本实验中, D25组螺体粗蛋白、粗脂肪及灰分含量显著高于D0组; 当玉米DDGS替代豆粕蛋白比例≥50%时, 对中华圆田螺幼螺的体成分无显著影响。玉米DDGS中的抗营养因子含量比豆粕等植物蛋白源中的含量低, 适量添加可促进水产动物的营养代谢[42]。
3.3 玉米DDGS替代豆粕蛋白对中华圆田螺幼螺消化酶活性的影响
消化酶是维持机体正常代谢的活性物质, 消化酶活性直接反应了机体对营养物质消化吸收的能力[43—45]。在饲料中添加20%和26.67%的玉米DDGS可造成珍珠龙胆石斑鱼肠道胰蛋白酶活性显著降低, 肠道脂肪酶活性随替代水平的增加呈先升高后降低的趋势, 但替代水平对肠道淀粉酶活性无显著影响[39]。在饲料中添加玉米DDGS对花鲈(Lateoldbrax japonicus)肝脏和前肠蛋白酶活性及肝脏淀粉酶活性均无显著影响[46]。在本实验中, 不同比例玉米DDGS替代豆粕蛋白对中华圆田螺幼螺肝胰腺和肠道淀粉酶活性均无显著影响。当玉米DDGS替代比例≥50%时, 显著降低了中华圆田螺幼螺肝胰腺和肠道胰蛋白酶及脂肪酶活性, 高水平的玉米DDGS粗纤维含量过高影响肠道健康进而影响营养物质的吸收[39]。另外, 玉米DDGS添加比例过高时, 饲料氨基酸组成不平衡, 消化率降低, 引起肠道炎症反应致使肠道损伤, 抑制饲料中养分的消化吸收, 进而影响水产动物的生长性能[47]。
3.4 玉米DDGS替代豆粕蛋白对中华圆田螺幼螺肝胰腺和肠道抗氧化及免疫指标的影响
水生动物的营养状况和健康状况可以通过抗氧化能力进行评估[48]。AKP和ACP是溶酶体的组成部分, 是水产动物重要的先天免疫酶[49], 同时在营养物质的消化、吸收和运转过程中起重要作用[50]。当肝脏受到有毒物质的损伤时, AKP活性升高并发挥其解毒功能[51]。ACP在生物体内主要通过参与磷酸基团的代谢和转移, 间接提高了机体的非特异性免疫[52]。随着饲料中玉米DDGS替代豆粕水平的升高, 刺参(Apostichopus japonicus)体腔液中ACP的活性呈先上升后下降的趋势[53]。本实验结果表明, 高水平玉米DDGS替代豆粕蛋白显著升高了中华圆田螺幼螺肝肠ACP和AKP的活性。推测是由于玉米DDGS中丰富的β-葡聚糖刺激了中华圆田螺幼螺的免疫系统[36]。因为玉米DDGS在发酵过程中融入的酵母细胞富含刺激巨噬细胞进行吞噬的β-葡聚糖、甘露醇二酸和角质素, 酵母细胞壁中的甘露寡糖和β-1,3/1,6-葡聚糖等成分会激发机体的免疫功能[54]。随着饲料中玉米DDGS替代水平的提高, 珍珠龙胆石斑鱼肠道炎症加重[39]。GPT和GOT是水生生物体内重要的两种氨基酸转氨酶, 存在于水生生物线粒体中[55], 其活性也是衡量水生生物肝损伤的指标[56]。随着饲料中植物蛋白替代比例的增加(60%—100%), 星斑川鲽(Platichthys stellatus)肝脏中GPT和GOT活性显著高于对照组[57]。本实验结果与上述实验相似, D75组中华圆田螺幼螺肝胰腺GPT和GOT活性显著高于D0组, 表明饲料中高水平的玉米DDGS可能会造成中华圆田螺幼螺肝功能损伤。SOD可以清除${\rm{O}}^-_2 $, 防止细胞损伤[58, 59]。CAT和GPx可以催化H2O2转化成H2O和O2[60]。MDA是脂质过氧化作用形成的产物, 其含量的高低可反映机体内脂质过氧化的程度及间接地反映机体细胞受自由基攻击的程度[61]。添加10%、17.5%和25%的玉米DDGS替代鱼粉对大菱鲆幼鱼各组肝脏中GPX、谷胱甘肽还原酶(GR)、CAT和SOD活性无显著影响[38]。金头鲷肝脏抗氧化酶的活性随饲料中玉米DDGS添加水平的升高而降低[13]。在本实验中, 当玉米DDGS替代比例为25%时, 肝胰腺和肠道抗氧化酶的活性与D0组相比均无显著差异, 当替代比例≥50%时, 抗氧化酶的活性均降低, 表明饲料中高比例玉米DDGS会降低中华圆田螺幼螺的抗氧化能力。
日粮中豆粕替代45%鱼粉时, 大菱鲆肝脏sod和gpx基因的表达水平显著下降[62]。当饲料中豆粕、花生粕和菜粕混合的植物蛋白添加水平由50%提高至70%时, 中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)肝胰腺cytmnsod和mtmnsod基因的表达水平明显下降[63]。在本实验中, 随着玉米DDGS替代比例的增加, 中华圆田螺幼螺肝胰腺及肠道中GPx和GST基因的表达水平显著降低, 表明饲料中玉米DDGS含量较高时可能通过抑制抗氧化基因的表达降低肝胰腺和肠道内的抗氧化酶活性, 从而减弱了中华圆田螺幼螺的抗氧化性能。这可能是由于玉米DDGS中氨基酸不平衡或有毒物质造成的[33]。
3.5 玉米DDGS替代豆粕蛋白对中华圆田螺幼螺肝胰腺和肠道组织结构的影响
肝胰腺是软体动物对营养物质进行消化、吸收、储存的重要器官, 同时在机体防御及解毒过程中起重要作用[64]。肝细胞结构的变化通常由毒性物质引起, 但也受营养状况影响[65]。饲料中添加20%和30%玉米DDGS使欧洲鲶肝细胞空泡化状况减少, 可能是玉米DDGS有更好的脂肪酸组成从而改善了脂肪代谢和肝组织形态[14]。但另有研究表明, 随着饲料中玉米DDGS含量的增加, 肉鸡的肝脏开始出现病变[66]。在本实验中, 当玉米DDGS替代比例≥75%时, 肝胰腺部分组织出现结构改变, 如部分肝小管结构紊乱、基膜破裂。这些变化表明高水平玉米DDGS可能对中华圆田螺幼螺肝胰腺功能造成了影响[14]。玉米DDGS较容易滋生霉菌, 可引起动物霉菌毒素中毒, 免疫低下, 肝功能受损[33]。
肠道是水生动物物质消化、免疫保护及调节水和矿物质平衡的重要场所, 肠道上皮的完整性在吸收营养方面起着至关重要的作用[67]。饲料中添加玉米DDGS对欧洲鲶肠道形态、上皮细胞长度、杯状细胞数量和大小没有显著影响[14]。在珍珠龙胆石斑鱼饲料中添加33.33%玉米DDGS对其肠道的皱襞宽度和肌层厚度无显著影响, 但会显著降低石斑鱼肠道皱襞高度, 减少杯状细胞数量, 微绒毛受损严重[39]。李维等[68]对玉米DDGS中霉菌毒素进行检测, 发现玉米DDGS中黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮等毒素阳性率很高, 这将会引发中毒现象的发生, 从而影响到动物肠道健康。在本实验中, 当玉米DDGS替代比例增加至50%和75%时, 上皮细胞排列松散和固有层萎缩。玉米DDGS中较高的粗纤维和不饱和脂肪酸含量可能是肠道受损的重要因素。粗纤维含量过高可能会增加肠道的消化负担, 引起肠道机械性损伤[39]。而不饱和脂肪酸易发生氧化, 降低饲料的营养价值, 并对肠道细胞产生毒性作用[35]。此外, 玉米DDGS中氨基酸组成的不平衡也可能影响肠道黏膜细胞的正常代谢和功能[27]。
4. 结论
饲料中玉米DDGS替代25%豆粕蛋白时, 不会对中华圆田螺幼螺的生长性能、消化酶活性、抗氧化能力和消化系统组织结构等造成不良影响。在本实验条件下, 综合生长性能、体成分、生理生化指标及组织结构等结果, 中华圆田螺幼螺饲料中玉米DDGS含量以不超过13.63%为宜。要确切得出最佳替代量, 未来可开展进一步的研究。
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