动物肠道内生活着大量的微生物, 包括真核微生物、细菌、古菌和病毒等^[1]。在肠道微生态系统中, 各种微生物与宿主经过长期的协同进化, 在调节宿主生理生化反应、促进消化吸收、介导宿主免疫应答和抵制宿主疾病发生等方面发挥着重要的作用, 以至于被认为是动物额外的器官^[2—5]。这些与肠道联系紧密的共生菌群, 与宿主相互作用, 共同维系整个肠道生态系统平衡与稳定。然而, 肠道正常菌群不是一成不变的, 可因环境、饵料、宿主行为和基因型等的不同有所差异, 但总体上处于相对稳定状态^[6—9]。

有研究表明, 有些肠道微生物只是随机进入肠道或暂时生活于此, 而某些病原微生物入侵肠道微环境, 可直接或间接影响肠道正常菌群的平衡与稳定^[10]。Li等^[11]研究发现, 患有疖病的圆口铜鱼肠道菌群多样性显著低于健康圆口铜鱼, 且肠道菌群在患病个体间的差异也远大于健康个体间差异。对患有“红鳃病”的鲫与健康鲫肠道菌群进行对比分析, 也得出相似的结论^[12], 这表明病原入侵会导致肠道菌群发生紊乱。

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是我国最为重要的淡水养殖鱼类, 在长江、珠江流域养殖量极大^[13]。草鱼幼苗容易感染病原发病, 其中威胁最大的是草鱼出血病(Grass carp hemorrhage)。草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus, GCRV)是草鱼出血病的主要病原, 其致病类型主要有3种: “红肌肉型”、“红鳍红鳃盖型”、“肠炎型”^[14]。其中, 患肠炎型(由GCRV感染草鱼引起的肠道炎症)出血病会导致草鱼肠道微生态环境发生剧烈变化^[15]。目前有关草鱼肠道菌群的研究多局限于从成年草鱼消化道内分离培养与纤维素水解相关的微生物, 研究不同饵料饲喂下草鱼消化道微生物的群落结构, 以及影响草鱼消化道微生物群落结构的因素等^{[9, 16—18]}, 关于GCRV感染对草鱼肠道菌群的影响研究还鲜见报道。对此, 本研究运用高通量测序技术, 对健康草鱼和人工感染GCRV草鱼肠道菌群进行了比较研究, 以期为该病的防治提供肠道微生物方面的依据和参考。

1.   材料与方法

1.1   实验材料与样品采集

实验草鱼(体重20—30 g/尾)来自于中国科学院水生生物研究所官桥养殖基地, 采样前1周转移至中国科学院水生生物研究所室内养殖系统, 水温控制在24—28℃, 期间投喂人工配合饲料。室内驯化1周后选规格相同的草鱼随机分成病毒感染组和对照组。病毒感染组草鱼通过浸泡在GCRV水溶液中10min, 对照组草鱼则浸泡在不含GCRV的水溶液中10min作对照处理。分别于感染GCRV后第2、第4、第6天(从处理组开始有草鱼表现出不适到因感染病毒导致死亡过程)分别随机各取3尾感染组和对照组草鱼进行后续分析。在第6天实验组增加3尾死亡草鱼样品的分析(因此对照组共9尾, 感染病毒处理组12尾)。由于草鱼个体较小, 肠道样品取整个肠道用来提取菌群DNA, 样品的具体采集和处理方法参照文献[19]进行。

1.2   草鱼肠道菌群16S rRNA基因高通量测序分析

草鱼肠道菌群DNA采用MoBio PowerFecal试剂盒参照说明书提取, 基因组DNA保存在–20℃; 首先, 用NanoDrop检测DNA样品的浓度, 将所有DNA样品浓度稀释到2 ng/μL用于PCR扩增。16S rRNA基因PCR扩增参照Wu等^[20], 步骤如下: 25 μL反应体系中包含1×Buffer II, 正、反向引物(515F、806R)各0.8 μmol/L, 0.5U的AccuPrime^TM Taq酶和10 ng模板DNA序列, 每个样品平行做3个重复, 并设阴性对照; PCR扩增程序如下: 94℃ 1min, 后接10个循环(94℃ 20s, 53℃ 25s, 68℃ 45s)之后68℃ 10min。PCR产物经Agencourt Ampure XP纯化后再次作为模板进行第二次PCR扩增, 扩增条件和第一轮PCR一致, 但是所使用的反向引物加了barcode标记, 并进行20个循环, 此两步法PCR能很好地降低barcode引物的扩增偏好性^[20]。最后, PCR产物用1%琼脂糖胶进行检测。在所有样品都成功扩增后, 各样品PCR产物用PicoGreen (Molecular Probes)进行定量。300 ng样品的PCR产物等量混合, 并用琼脂糖凝胶在90 V下电泳2h, 目的片段使用DNA纯化试剂盒(Qiagen)纯化后再次进行PicoGreen定量, 建库后使用MiSeq测序平台进行测序。所得到DNA序列分析参照Wu等^[20]的方法进行分析, 并通过RDP (Ribosomal Database Project)数据库进行比对和OTU分类。

1.3   数据分析

分析过程使用R语言环境和PAST 2.0软件, 其中, R语言使用了vegan、VennDiagram、ggplot 2和ggfority程序包。进行的分析主要包括: (A)每个肠道样品做OTU稀释性曲线; (B)计算每个样品的Alpha多样性, 参数包括: 香农指数(Shannon-Wienner index)、辛普森指数(Inverse Simpson index)、皮鲁均匀度指数(Pielou evenness index)、辛普森均匀度指数(Simpson evenness index); (C)计算了Beta多样性, 包括非参数检验: 基于Bray-Curits距离的MRPP (Multiple-Response Permutation Procedure)、Anosim (Analysis of Similarity)、Adonis分析。同时也进行了主成分分析(Principal component analysis, PCA); (D)通过维恩图(Venn diagram)统计两组样品共有(shared)和特有(Unique)OTU; (E)用SPSS 24.0对实验组和对照组Alpha多样性指数进行独立样本t检验(Independent samples t-test)、对肠道菌群在处理组和对照组组内两两个体间距离均值进行威尔科克森检验(Wilcoxon test)以及对两组样品肠道优势OTU (relative abundance>1%)进行t检验(t-test)。

2.   结果

2.1   肠道菌群Alpha多样性分析

Alpha多样性分析结果表明, 除辛普森均匀度指数外, 感染组的香农指数、辛普森指数、皮鲁均匀度指数均显著低于对照组(t-test, P<0.05), 表明GCRV感染使草鱼肠道菌群的物种多样性和均匀度明显降低(图 1)。对每个样品进行OTU稀释性曲线的分析中, 也发现了相似的规律, 感染组样品OTU数普遍低于对照组(图 2)。

图  2  处理组和对照组样品物种丰度的稀释曲线

Figure  2.  Rarefaction curves between treated and control groups based on sequencing results

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图  1  处理组(右边)和对照组(左边)草鱼肠道菌群Alpha多样性指数比较

槽口图包括四分位间距(IQR), 第一、第三和第四分位数, 内侧粗线代表中位数; *表示显著性水平P<0.05, n.s.表示差异不显著

Figure  1.  Comparing alpha-diversity index between treated (right) and control (left) groups

The notch boxes include the interquartile range (IQR), from the first, third and fourth quartiles, and the inside bold line represents the median. *indicate P<0.05, n.s., not significant

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2.2   肠道菌群Beta多样性分析

图 3显示对照组草鱼肠道内总共有646个OTUs, 而病毒处理组则检测到了498个OTUs, 相比对照组减少了148个OTUs。此外, 对照组中特有的OTUs为394个, 而GCRV感染后草鱼特有OTUs为246个; 2组草鱼共有OTUs数为252个。

图  3  处理组和对照组OTU数量对比维恩图

Figure  3.  Venn diagram representing shared OTUs between treated and control groups

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对所有样品进行基于Bray-Curits距离的差异分析(表 1), 结果表明GCRV感染组草鱼和对照组草鱼肠道菌群差异显著(MRPP, Anosim, Adonis, P<0.01)。

表  1  基于Bray-Curits距离的差异显著性检验

Table  1.  Comparing the results of dissimilarity test between the treated and control groups based on Bray-Curtis dissimilarity

指标 Item	实验组 vs. 对照组 Treatment vs. Control
MRPP. Delta	0.527
MRPP. P-value	0.002**
Anosim. R-value	0.192
Anosim. P-value	0.020**
Adonis. F-value	2.976
Adonis. P-value	0.007**
注: ** 表示显著性水平P<0.01Note: The double asterisk indicates a significant difference withP<0.01

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对所有草鱼样品肠道菌群进行PCA排序(图 4A), 对照组各样点聚集较为紧密, 说明肠道菌群在个体之间的差异较小。处理组草鱼各样点相距较远, 说明肠道菌群在个体之间的差异较大。此外, 第一轴(PC1)的解释变异量为63.73%, 第二轴(PC2)的解释变异量为21.67%, 2个轴解释变异量累计高达85.4%。对处理组和对照组肠道菌群在组内个体间Bray-Curtis距离进行比较, 发现肠道菌群在病毒感染组不同个体间的平均距离要显著高于对照组草鱼(Wilcoxon test, P<0.05,图 4B)。

图  4  PCA排序图(A)及处理组和对照组(B)组内个体间距离差异比较

* 表示显著性水平P<0.05

Figure  4.  Comparing beta-diversity index between the GCRV-infected and healthy grass carps A. The treated and control samples were visualized by PCA. B. Comparing Bray-Curtis dissimilarities between individuals in the GCRV-infected and control groups

* indicate P<0.05

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2.3   肠道菌群组成

在门水平进行分析比较发现(图 5), 对照组样品中共检测到18个菌门, 分别为脱铁杆菌门(Deferribacteres)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、装甲菌门(Armatimonadetes)、泉古菌门(Crenarchaeota)、衣原体门(Chlamydiae)、柔膜菌门(Tenericutes)、浮霉菌门(Planctomycetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、蓝藻门(Cyanobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、螺旋体门(Spirochaetes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、梭杆菌门(Fusobacteria)和其他未被分类的细菌。而实验组样品中则总共检测到15个菌门, 与对照组相比少了脱铁杆菌门、芽单胞菌门、装甲菌门、泉古菌门, 但新增了栖热菌门(Deinococcus-Thermus)。在所有的菌门中, 处理组与对照组共有优势菌门为变形菌门、梭杆菌门、厚壁菌门、拟杆菌门, 4个优势菌门在GCRV感染组和对照组草鱼肠道菌群中所占得比例分别为98.3%和97.4%。

图  5  实验组与对照组肠道微生物在门水平相对丰度比较

‘trt_’和‘ctr_’分别表示处理组、对照组, trt_和ctr_之后的数字表示样品编号

Figure  5.  Relative abundance of the phyla in the treated and control groups

‘trt_’ and ‘ctr_’ represent treated and control grass carp, respectively. The numbers indicate sample ID

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将相对丰度大于1%的OTU进行比较发现, 对照组草鱼样品优势OTUs有17个, 而GCRV感染的草鱼样品优势OTUs有10个(表 2)。处理组草鱼肠道内OTU_504 (Comamonadaceae, 丛毛单胞菌科)、OTU_69 (Pasteurellaceae, 巴斯德氏菌科)、OTU_1898 (Cetobacteriu, 鲸杆菌属)和OTU_822 (Uliginosibacterium)相对丰度显著低于对照组(t-test, P<0.05)。OTU_504 (丛毛单胞菌科)在健康草鱼体内相对丰度为5.4%, 而在处理组草鱼肠道内则仅为1.5%。OTU_1898 (鲸杆菌属)和OTU_1357 (Gammaproteobacteria, γ变形菌纲)在对照组草鱼肠道样品的相对丰度分别为3.5%和10.5%, 而在处理组则下降为1.1%和8.8%。其他OTU感染GCRV后也有不同程度的下降, OTU_66 (Neisseriacea, 奈瑟氏球菌科)、OTU_98 (Shewanella, 希瓦氏菌属)、OTU_163 (Chitinophagaceae)、OTU_471 (Clostridiales, 梭菌目)和OTU_94 (Neisseriacea, 奈瑟氏球菌科)等在病毒处理组相对丰度降至1%以下。然而, 也有部分OTU相对丰度在感染GCRV后反而增加了, 其中增加幅度最为明显的是OTU_434 (Cetobacteriu, 鲸杆菌属), 该OTU的相对丰度在感染病毒的草鱼肠道内急剧上升, 由29.3%上升至46%。同样, OTU_1154 (Vibrionaceae, 弧菌科)上升幅度较大, 由1.5%增至12.3%。此外, 处理组中新增加一优势OTU, 即OTU_48 (Vibrio, 弧菌属)。OTU_893 (Aeromonas, 气单胞菌属)在两组肠道样品中相对丰度差别不大。

表  2  相对丰度大于1%的OTU对比分析

Table  2.  OTU with relative abundance greater than 1% in treated and control groups

实验组Treatment				对照组Control
分类单元OTU	相对丰度Abundance (%)	分类Classification		分类单元OTU	相对丰度Abundance (%)	分类Classification
OTU_434	46.0	Cetobacterium		OTU_434	29.3	Cetobacterium
OTU_1154	12.3	Vibrionaceae		OTU_1357	10.5	Gammaproteobacteria
OTU_1357	8.8	Gammaproteobacteria		OTU_822*	5.4	Uliginosibacterium
OTU_806	4.1	Leuconostoc		OTU_504*	4.8	Comamonadaceae
OTU_893	3.0	Aeromonas		OTU_806	4.4	Leuconostoc
OTU_48	2.0	Vibrio		OTU_1898*	3.5	Cetobacterium
OTU_504	1.5	Comamonadaceae		OTU_893	3.1	Aeromonas
OTU_1832	1.3	Lactococcus		OTU_69*	2.8	Pasteurellaceae
OTU_1898	1.1	Cetobacterium		OTU_436	1.6	Neisseriaceae
OTU_822	1.0	Uliginosibacterium		OTU_1154	1.5	Vibrionaceae
				OTU_66	1.4	Neisseriaceae
				OTU_98	1.3	Shewanella
				OTU_163	1.2	Chitinophagaceae
				OTU_471	1.2	Clostridiales
				OTU_94	1.1	Neisseriaceae
				OTU_1832	1.0	Lactococcus
				OTU_26	1.0	Pelomonas
注: *显著性水平为P<0.05Note: * indicateP-values significant at 0.05 level

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3.   讨论

鱼类肠道内定植着种类丰富、数量庞大的菌群^{[21, 22]}。在正常情况下, 肠道菌群之间、菌群与宿主之间处于动态平衡, 从而维持着鱼类肠道正常生理功能^[5]。但当受到病原微生物感染时, 肠道菌群的平衡状态受到干扰后可能被打破^{[11, 12]}。肠道菌群结构失衡可能使得宿主的免疫系统受到影响, 某些条件致病菌还有可能会转移或危及宿主其他组织器官, 导致细菌性疾病爆发^{[23, 24]}。因此, 肠道微生态的相对稳定对于宿主的健康有着重要的意义。

中国水产养殖占世界水产养殖总量的近70%^[25], 其中草鱼是我国最重要的淡水养殖鱼类。在草鱼养殖常见的疾病中, 草鱼呼肠孤病毒导致的出血病常常给养殖业造成了严重的经济损失。感染该病毒的草鱼, 其肠腔内黏液减少, 上皮细胞大量坏死脱落^[15], 肠道微生态环境的急剧恶化, 因此肠道菌群很有可能失去原有的平衡状态而变得紊乱。虽然以往的研究表明病原感染可引起水生动物肠道群菌紊乱^{[11, 26]}, 但GCRV感染对草鱼肠道菌群的影响尚不清楚。

本研究利用MiSeq高通量测序研究了GCRV感染对草鱼肠道菌群的影响, 结果表明GCRV感染使得草鱼肠道的微生物群落结构发生了显著变化(MRPP, Anosim, Adonis, P<0.01), 李东亮等^[27]用嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)感染草鱼得到类似的结果。肠道作为一个小型生态系统, 众多的微生物栖息于此并形成复杂的生态群落^[28]。肠道正常菌群及肠道生态系统的稳定性与肠道功能密切相关^[29]。本研究发现, GCRV感染组草鱼肠道菌群Alpha多样性显著低于对照组草鱼(Independent samples t-test, P<0.05), 说明肠道微生态系统发生了紊乱。在正常情况下, 肠道正常菌群牢固地附着于肠黏膜和肠上皮细胞表面。但感染GCRV后, 其肠腔内黏液减少、上皮细胞成片脱落^[15], 正常菌群因失去附着位点而极易随排泄物排出体外。此外, 发生肠炎的草鱼摄食减弱, 导致肠道正常菌群赖以生存的资源减少, 也可能是部分肠道正常菌群数量减少的原因之一^[30]。

已有基于DGGE^[19]、纯培养^[16]和高通量测序^{[31, 32]}的结果表明, Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes、Fusobacteria为草鱼肠道的主要类群, 本研究结果与之相符。然而与健康草鱼相比, 感染GCRV的草鱼肠道内Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes相对丰度均有不同程度的下降, 而Fusobacteria则有较大幅度增加。其他非优势菌门如Deferribacteres、Gemmatimonadetes、Armatimonadetes、Crenarchaeota在病毒感染组中消失。这些变化, 一方面, 可能与患病草鱼摄食减少导致肠道中可利用的资源减少有关^[33]。另一方面, 可能与感染病毒后肠道微生态环境恶化存在关联^[15]。此外, 有研究表明免疫系统对肠道菌群有着重要的影响^{[34, 35]}。而GCRV对草鱼免疫系统有着重要的影响^[36], 因此, GCRV病毒也有可能通过干扰草鱼免疫系统间接影响肠道菌群组成, 但还有待进一步证实。

研究表明感染GCRV的草鱼肠上皮细胞会大量脱落^[15], OTU_434相对丰度在感染组明显升高, 该OTU在Cetobacteriu丰度占比极高(96%) , 可能与Cetobacteriu能合成的维生素B12 (Vitamin B12)促进肠道细胞修复有关^{[36, 37]}。感染GCRV后OTU_98 (Shewanella)在肠道中相对丰度有所下降。有研究表明饥饿能够改变肠道菌群^{[38, 39]}。在本实验中, Shewanella(OTU_98)相对丰度降低可能与患病草鱼摄食减少, 肠道营养贫乏有关^[40]。

综上所述, GCRV感染会导致草鱼肠道正常菌群紊乱。肠道菌群发生紊乱往往伴随着致病菌过度增殖, 引起肠道微生态失衡和机体的炎症反应, 导致疾病的发生或病情的加重^[41]。健康宿主肠道微生物可通过与致病菌竞争黏附位点、介导调节肠道免疫应答等方式抑制病原菌的增殖, 来缓解或防止肠道炎症^[5]。因此, 如果能从草鱼肠道内分离出这些有益微生物并制成微生态制剂投喂草鱼, 或许能使已发生紊乱的肠道菌群恢复至正常状态, 从而为缓解或防止草鱼出血病提供帮助。本研究从草鱼肠道菌群入手, 能为草鱼病毒性出血病的防治和深化研究提供依据和参考。