水霉拮抗菌的筛选及其拮抗作用的初步研究
SCREENING OF ANTAGONISTIC BACTERIUM STRAIN AGAINST SAPROLEGNIOSIS AND THE PRELIMINARY STUDY OF IN VITRO ANTAGONISTIC ACTIVITY
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摘要: 为了获得水产动物水霉病病原菌的拮抗微生物,以水霉为靶标,对其拮抗菌进行了筛选,并研究了拮抗作用最强菌株的拮抗活性。实验结果表明:从发生过水霉病害的水体中分离得到了130株细菌,能抑制水霉菌落生长的有三株:LD038、LD057和LD106,其中以LD038的拮抗作用最强,经梅里埃ATB微生物自动鉴定系统鉴定为黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens)。培养基对LD038的拮抗活性影响显著,LD038在PDA平板上表现出的拮抗活性最强,大小依次为PDABHIGYCASabouraud。进一步对菌株LD038体外拮抗活性进行了研究。平板抑制实验表明,LD038能抑制水霉菌丝生长和孢子萌发。琼脂扩散法中,LD038菌落周围产生的抑菌圈直径为20mm,而无菌水对照组中水霉菌丝蔓过滤纸纸片并长至平板边缘;D38菌线间孢子的萌发与孢子距菌线的距离有关,距LD038菌线22mm范围内,孢子的萌发完全被抑制。无菌发酵上清液实验表明,与对照组相比,LD038无菌发酵上清液对孢子的萌发和菌丝生长都表现出显著的抑制作用。其中孢子较菌丝对上清液更为敏感,5倍稀释上清液下的孢子萌发率仅为10%,且萌发后的菌丝生长也同样受到抑制,整个实验过程中菌丝均未形成网状,对照组中萌发形成的菌丝在16h后呈网状。无菌上清原液和2倍稀释上清液中孢子均未萌发。对菌丝而言,仅无菌上清原液能彻底抑制菌丝生长,与对照组相比,2倍和5倍稀释上清液显著延缓了菌丝的生长。当对照组中的菌丝铺满整孔时,2倍和5倍稀释上清液中的菌丝长度分别为0和2.6mm。显微观察表明LD038的无菌发酵上清液导致水霉菌丝形态发生变化,较正常菌丝短而粗大,且出现了黑色原生质聚集。本研究为水霉病害的生物防治提供了一定的理论基础和依据。Abstract: Pathogenic members of the genus Saprolegnia are the common causative agent of saprolegniosis in aquaculture. In order to find an ideal biological control method for these fungi,the antagonistic bacteria were screened from the pond in which severe outbreak of saprolegniosis occurred. The results showed that 3 out of 130 isolates exhibited in vitro inhibition of Saprolegnia hyphal growth on BHI agar plate inoculated with two parallel streaks of each bacterium. Three strains showed antagonistic effect were named as LD038,LD057 and LD106,respectively. The strain LD038 identified as Serratia marcescens using Automated Microbiology Systemfor the identification of bacteria showed the strongest antagonistc activity among three stains mentioned above. Furthermore,we examined the in vitro antagonism of LD038 against Saprolegnia.Among five media examined,the LD038 exhibited the strongest antagonism using PDA media on which the inhibition zone was about 12mm. The LD038 on CA,GYand BHI media also exhibited antifungal activity,and the inhibition zones ranged from 3mm to 9mm. However,the LD038 on Sabouraud media could not inhibit the growth of Saprolegnia hyphae at all. In addition,the plate assay showed that the LD038 was able to inhibit Sapro legnia hyphal growth on PDA plate using agar diffusion method.And the inhibition zone induced around LD038 colony was about 20mm,whereas Saprolegnia hyphae reached the edge of plate on the controls without the LD038.Moreover,cyst germination of Saprolegnia was also inhibited to a great extent between two parallel streaks of the LD038,and the inhibitory activity was related to the distance fromthe streak of LD038,the inhibition zone was about 22mmin which cyst germination was completely inhibited1 In the broth assay,serial diluted cell-free culture supernatants of the LD038 significantly inhibited Saprolegnia hyphal growth and cyst germination compared with the controls,and Saprolegnia cysts were more sensitive than Saprolegnia hyphal. Saprolegnia cysts were able to germinate in the 1/5 diluted cell-free culture supernatant,but the germination rate was only 10 % in comparison to 96.3 % recorded for the controls. The hyphal growth from germinated cysts was also inhibited.And Saprolegnia hyphae formed hyphal nets in control wells 16 hours later,while the hyphae in the 1/5 diluted cell-free culture supernatant were halted with no branching over the whole experiment. In contrast,the non-diluted and 1/2 diluted cell-free culture supernatants of LD038 completely inhibited the Saprolegnia cyst germination.With respect to Saprolegnia hyphal,only the non-diluted cell-free culture supernatant completely inhibited the hyphal growth,while the 1/2 and 1/5 diluted cell-free culture supernatant postponed Saprolegnia hyphal growth.When the whole control well was confluent with Saprolegnia hyphae,the lengths of hyphae in wells treated with the 1/2 and 1/5 diluted cell-free culture supernatant were 0 and 2.6mm respectively,and Saprolegnia vegetative hyphae began to erupt from agar block in the 1/2 diluted supernatant 20 hours later. Phase-contrast microscopic examination showed that the hyphae in treated groups revealed extensive morphological changes including granulation of the cytoplasm,short and enlargement of hyphae1 On the contrary,the hyphae in the controls were slender containing a clear and granule free cytoplasm. Our study will provide theoretical foundation for biocontrol of saprolegniosis in aquaculture in future.
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Keywords:
- Saprolegnia /
- Antagonistic bacteria /
- Biocontrol /
- Serratia marcescens
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鱼类育种技术是水产养殖业可持续发展的重要保障, 目前已有大量的遗传育种手段应用于鱼类育种[1]。在各类经济鱼类的选育过程中, 所得到的子代群体往往数量庞大, 为了保证饲养环境条件的一致而将多个家系群体同池混养, 后期重建亲本与子代之间的对应关系时, 需要使用亲子鉴定技术[2]。
在通常情况下, 亲子鉴定主要根据孟德尔遗传定律, 以分子标记作为依据来判断具体的子代与亲代之间是否存在亲子关系。目前亲子鉴定主要采用微卫星(Simple Sequence Repeat, SSR)和单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)这两种分子标记, 其中SNP在人类亲子鉴定中应用较多[3], 而SSR主要应用于水产养殖育种[2, 4－6]。SSR具有信息含量高、多态性好的优点[7], 但标记本身的筛选过程比较繁琐, 而且后续的亲子鉴定实验也较多地依赖于人力劳动, 样本量较大时, 耗时长, 效率低; 相比之下, SNP标记则具有不易发生变异和易于分析的优点, 但其多态性较低[8], 需要使用较多的SNP标记才可达到与SSR标记同等的效果。理论上SSR标记可以直接从测序数据与参考基因组比对后所得的插入缺失(INDEL)区域中进行筛选而获得[9, 10], 但直接获得SSR的方法都受限于reads长度及碱基滑移方式, 对于重复次数相近或超过reads长度的SSR无法进行有效分型[10], 因此主要还是依靠传统的实验手段来检测。单个SNP位点的分型也可以通过多种测序技术获得, 2011年Davey等[11]对这些技术进行了总结, 包括重测序技术和RAD-seq(Restriction-site-associated DNA sequencing)等简化基因组测序技术, 其中重测序技术可以获得全基因组范围内的SNP位点, 而简化基因组测序技术只能获得部分SNP位点, 但相较而言其成本较低。在水产动物的遗传育种研究中, SSR分子标记主要用于亲子鉴定[12－14]和群体遗传多样性分析[15]等工作, SNP分子标记则主要应用于遗传连锁图谱构建[16]和GWAS分析[17]。
2013年Kidd等[18]结合上述两种分子标记的优点, 提出了微单体型(Microhaplotype, MH)的概念, 这是指长度在200 bp以内、可连锁遗传的SNP组合。作为一种分子标记, MH多态性高并且能够稳定遗传, 已应用于法医行业[18－20]、人类群体分析[21, 22]及祖先推断[23, 24]等。2018年, Garciafernandez等[25]以每个目标基因中的所有SNP位点作为一个单体型(Haplotype)分子标记, 即长片段的连锁遗传的SNP组合, 应用于鲷(Sparus aurata)的亲子鉴定。另外微单体型分子标记也曾用于分析墨绿平鲉(Sebastes atrovirens)的亲缘关系[26], 然而迄今没有应用于鱼类亲子鉴定。
目前获取微单体型或单体型分型的方法主要有两种: 第一种方法是根据所获得的各个SNP位点, 用群体遗传学的手段进行单体型推断; 第二种方法是直接用个体基因组的测序数据的单体型组装。用群体遗传学推断方法的常用软件HaploView[27]、PHASE[28]、SHAPEIT[29]和Beagle[30]等, 它们对群体大小的依赖性较强, 对于大样本群体可以获得较准确的分型结果[31]。然而, 在鱼类的遗传育种中亲本数量通常较小[4, 15, 32], 难以获得适用于此方法的足够数量样品, 不容易做到准确分型。基于序列组装的软件主要有HapCUT2[33]、ReFHap[34]以及FLfinder[35]等, 目前仅用于单体型的推断与分型, 而未应用于微单体型的分析。这种方法不受样本数量限制, 仅对测序深度敏感, 测序深度不足时无法获得准确的分型结果[36], 但随着高通量测序成本的迅速下降, 测序深度已不再构成瓶颈问题。
本研究在基于个体测序数据的单体型组装的基础上, 开发了一套基于微单体型分子标记的亲子鉴定流程, 其核心为微单体型标记的获取、分型与筛选, 所需要样本更少且准确率高, 适用于已有参考基因组的二倍体水产动物。为评估新方法的效果, 我们以一个草鱼群体的全基因组重测序数据为例, 以其亲子鉴定结果与SSR鉴定结果的一致性为主要指标对新方法加以验证和评估。
1. 材料与方法
1.1 基于个体序列组装的微单体型获取与亲子鉴定流程
我们通过个体单体型组装软件获取微单体型, 整个亲子鉴定流程主要分为三个步骤(图 1): 第一步是获取亲本微单体型。通过与参考基因组进行比对, 获取每个亲本个体的所有SNP位点, 依据测序结果使用HapCUT2软件进行亲本个体的单体型组装, 从中选取微单体型区域, 将所有个体的区域集合起来, 获取在该基因片段上的微单体型区域。按照划分好的微单体型区域, 对每个个体进行微单体型组装及分型。然后对子代进行微单体型的分型。对于上面从亲本中得到所有微单体型区域, 为每个子代个体进行微单体型组装。将该区域上子代与亲本的全部分型结果形成列表, 依据各分型的索引构建每个个体在该微单体型下的分型结果。最后根据全部子代分型结果, 用CERVUS 3.0软件[37]进行亲子鉴定。
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图 1 微单体型获取和亲子鉴定流程Figure 1. Pipeline for microhaplotype genotyping and paternity testing1.2 微单体型区域(Microhaplotype region, MR)的划分
用HapCUT2软件处理亲本的重测序数据, 获取每个亲本个体的MR, 即一个单体型的首尾SNP位点在参考基因组上的位置。集中所有亲本个体的MR, 合并任何在位置上有重叠的MR, 构成一个序列较长的、信息量更高的MR总库。
接下来将总库中的每一个MR逐一与各亲本的MR进行比较。由于总库MR是合并所有亲本中相重叠MR所得, 那么, 每一个总库MR必然不短于单个亲本中与之有重叠的MR, 如果其非重叠区域(超出的部分)在该亲本序列中也存在杂合的SNP位点, 那么这个MR将按重叠与非重叠区域拆分成两个区域, 仅保留至少有2个SNP位点的区域作为新的MR, 这样可增加后续分析结果的准确性。最终所得的MR总库将用于后续分型研究。
1.3 微单体型分型及分析方法
依据MR总库可对各亲本进行微单体型的分型, 即针对总库中的每个MR确定各亲本的具体微单体型序列。二倍体亲本在每个MR最多只可能有2种微单体型, 这可以根据HapCUT2的分型结果筛选, 也可以参考该亲本与参考基因组比对所得的VCF文件来确定。如果由于测序错误或数据量不足, 无法明确地鉴定某MR的1—2种微单体型序列, 则舍弃该MR。剩下的各有效MR中所得到微单体型序列都可仅保留各SNP位点的碱基, 然后计算各MR在亲本群体中的信息熵, 公式如下:
$ H = - \mathop \sum \limits_{i = 1}^n {p_{i}}{\rm{lo}}{{\rm{g}}_2}\;{p_i} $
式中, n表示该MR中微单体型序列的种类数, pi表示第i种微单体型在亲本群体中出现的频率, H表示该MR在亲本群体中的信息熵。
使用与亲本微单体型分型的方法, 也可以在每个子代中获得各MR的微单体型序列, 用于后续的亲子鉴定工作。
1.4 基于群体遗传学方法的单体型分子标记获取与分析
传统上单体型标记是通过群体遗传学分析推断而获得的, 因此本研究也使用此方法进行了单体型分子标记的分型。分析过程比较简单: 首先通过SHAPEIT软件将每个基因构建一个单体型, 再依据各分型出现顺序标注每个个体的分型情况。
1.5 使用SSR标记进行亲子鉴定的方法
我们从草鱼参考基因组[36]中筛选部分短序列重复片段作为候选SSR标记, 并设计引物对2尾父本(1#和M10)和3尾母本(2#, F13和F40)进行扩增, 扩增程序为95℃预变性10min, 95℃变性45s, 55℃退火45s, 72℃延伸1min, 循环30次, 72℃延伸10min, 4℃保存。使用ABI 3730对各标记的扩增产物进行毛细管凝胶电泳, 以条带大小为分型依据判断其多态性。最终选取5个多态性高的SSR标记进行亲子鉴定, SSR标记的相关信息见表 1。171尾子代个体也同样进行目标SSR标记扩增及分型, 然后进行亲子鉴定分析。
表 1 用于亲子鉴定的SSR标记信息Table 1. Information of the SSRs used for the paternity test标记ID Marker ID PCR引物PCR primer (5′—3′) 重复片段Repeat motif 信息熵Informative index G5010 CATTTTACTGCTTGCCTCAC AGAAG 2.4464 CCCTTCCTTTCGCATAGA G5011 AAGCCACCAACCTCTACGA TTCTC 2.6464 TAACAGGGATGGGATGAAAT G5012 GATGACATGGGGGTGAGTAA AGAGA 2.7219 CAGAAAGGTAGTAAACAACGAAA G5020 CAACCCTGTTTCTGTCCTGT AAAGG 2.4464 GCAAGCAACTGTCAACCTG G5024 ATTCCTTCCGAAATCAGTG GAGAA 2.1710 AGAGGGAGAAAGATAAGACCA 注: 信息熵计算方法与1.3中一致Note: The informative index is calculated in the same way as 1.3 1.6 组装微单体型标记使用的数据及其处理方法
我们以草鱼基因组重测序数据(尚未发表)进行了微单体型组装, 数据来自上述五尾亲本及其171尾子代个体, 其中亲本测序深度为30X, 子代测序深度为15X, 并且评估了微单体型标记应用于亲子鉴定的结果与SSR鉴定结果的一致性。重测序数据经过了质量分析(FastQC)、与参考基因组的比对(BWA[38])等步骤, 最后利用SAMtools[39]和GATK4.0[40]软件获取各样本的SNP位点, 作为SNP信息集。
考虑到子代个体数并不多, 我们仅选择了15个富含SNP的基因, 即adamts20(ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif 20)、brca2(breast cancer 2)、dlc1(deleted in liver cancer 1)、gbp(guanylate binding protein)、lgals9(galectin 9)、lrp5(LDL receptor related protein 5)、meis2b(meis homeobox 2)、mrps23(mitochondrial ribosomal protein S23)、msi2(musashi RNA binding protein 2)、nos2b(nitric oxide synthase 2)、prtga(protogenin A)、rpz4(rapunzel 4)、snx14(sorting nexin 14)、thsd4(thrombospondin type 1 domain containing 4)和zmym4(zinc finger MYM-type containing 4), 以代表整个基因组来评估我们方法的效果, 这样就大大减少了计算量。从这15个基因中SNP的密度分布可以看出, 在这些基因中确实存在一些SNP较为集中的片段(图 2)。微单体型由连锁遗传的SNP位点组合构成且这些SNP位点通常距离较近, 因此这些分布较为集中的SNP可以组合成潜在的微单体型。
1.7 亲子鉴定标记组合(Paternity Test Marker Combinations, PTMC)筛选
为了获得PTMC, 我们首先依据亲本性别构建全部可能的亲本对, 为降低连锁遗传带来的影响, 随后依次挑选若干来源于不同基因的标记, 依据亲本的分型情况, 可得到每一个亲本对的后代在这些标记中的所有可能的分型组合。若存在某两个亲本对的子代分型有重合的情况, 则认为所选的标记组合无法进行亲子鉴定; 反之, 若所有亲本对的子代分型均唯一, 则认为所选标记组合可以用于亲子鉴定, 并作为可用的亲子鉴定标记组合(PTMC)输出。通过此步骤可以得到所有可能的PTMC, 从中选用平均信息熵最高的一套PTMC用于亲子鉴定可以提高结果的准确性。
基因组重组可能在子代中产生异于亲本的分型类型, 从而妨碍亲子鉴定。适当增加冗余标记可以应对这种分型矛盾。冗余标记的选择可以采用一种简单的策略, 即从与所有已选用标记位于不同基因(或染色体)上的标记中, 选择信息熵最高的一个。重复该过程则可以选择多个冗余标记。
2. 结果
2.1 基于个体序列组装的微单体型获取
我们亲本重测序数据对15个基因区域进行了微单体型的组装, 统计了每个基因上微单体型区域和SNP位点的数量, 以及第一个SNP位点到最后一个SNP位点之间的距离(表 2), 并计算信息熵作为评价微单体型区域信息量的标准。总体而言, 大部分微单体型区域的信息熵的值介于1和2之间(图 3A), 但其分布范围在各基因之中有较大的变化(图 3B), 并且信息熵值也随SNP数量的增长而呈上升趋势(图 3C)。
表 2 各基因上的SNP位点与微单体型区域的数量以及亲子鉴定准确率Table 2. SNP loci and MR in each gene and the accuracy of paternity testing基因Gene 长度Length (bp) SNP数Number of SNPs MR总数Total number of MRs 有效MR数Effective number of MRs 与用SSR鉴定结果的一致率Consistency with SSR’s results (%) 可鉴定子代占比Ratio of detectable offspring (%) adamts20 51075 188 32 18 99.40 97.08 brca2 16330 167 23 12 98.14 94.15 dlc1 21420 46 9 4 58.08 97.66 gbp 16058 35 6 3 29.46 75.44 lgals9 5112 14 1 0 — — lrp5 18312 89 13 4 38.57 81.87 meis2b 16360 43 9 2 63.75 46.78 mrps23 4348 28 4 1 12.77 54.97 msi2 2859 13 2 0 — — nos2b 11347 48 9 6 91.61 90.64 prtga 25714 158 25 16 99.41 99.42 rpz4 1138 18 1 0 — — snx14 45146 192 38 26 97.14 61.40 thsd4 7511 30 5 0 — — zmym4 12827 59 7 2 65.09 98.83 注: 其中“—”表示由于标记信息不足以完成亲子鉴定Note: “—” indicates the failure to perform the paternity testing due to insufficient information ![]()
图 3 基于个体序列组装的微单体型分析结果Figure 3. Analysis of the microhaplotypes assembled using the sequence data of individuals2.2 用单个基因的MR进行的亲子鉴定
亲子鉴定使用的软件为CERVUS 3.0[37], 参数为默认值。
由于亲本的测序深度高于子代, 有些从亲本上鉴定的MR序列在子代中没有被覆盖, 只有在所有子代中出现的MR才是有效MR。我们首先尝试将一个基因上的全部有效MR作为一套标记进行亲子鉴定, 其结果与用SSR鉴定结果的一致性见表 2。不同基因的鉴定能力差异很大, 其中adamts20、brca2、prtga和snx14鉴定的结果与SSR分析的一致性较高(>95%), 而gbp、lrp5、meis2b和mrps23的一致性较低(<50%)。亲子鉴定的效果与基因中微单体型标记的数量或信息熵之和存在一定的关系, 但并非简单的线性关系(R2=0.2302)。对于我们所测试的数据, 当基因中标记数或信息熵之和低于10时, 亲子鉴定的效果与之有正相关性, 但之后即达到饱和, 与SSR分析的一致性维持很高(图 4)。
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图 4 亲子鉴定一致性与MH标记数量(A)和各基因有效标记信息熵之和(B)的关系Figure 4. Consistency between the SSRs used in the paternity test and MH marker numbers (A) or the sum of the informative indexes of the markers within each gene (B)2.3 MR组合的选择与亲子鉴定
如果不考虑基因重组, 根据5个亲本所有标记的实际分型情况, 理论上仅需3个标记就能分辨出它们之间任何子代的亲本, 而这样的3标记组合总共有189个。从中选择平均信息熵最高的一组作为标记进行亲子鉴定, 结果在171个子代中, 与SSR鉴定结果不同的个体仅5个, 一致率达到97.08%。再逐次增加第1个和第2个冗余标记后, 不一致个体减少为2个和1个, 一致的比率进一步提高到98.83%和99.42%(表 3)。
表 3 所选用的MR标记与171尾子代个体的亲子鉴定Table 3. MR markers adopted and paternity test results of 171 offspring标记数量Number of markers 标记名字
Marker ID预测一致的子代数Number of offspring consistent with prediction 一致率Ratio of consistency (%) 3 prtga_14, gbp_2, brca2_1 166 97.08 4 prtga_14, gbp_2, brca2_1, adamts20_2 169 98.83 5 prtga_14, gbp_2, brca2_1, adamts20_2, snx14_5 170 99.42 2.4 基于群体遗传推断的单体型分型结果
除了使用单个个体的测序数据进行微单体型组装的方法外, 还可以利用群体遗传学的方法进行单体型推断, 从而获取微单体型分型。为了比较这两种方法在亲子鉴定上的区别, 我们使用SHAPEIT软件获取了上述176尾个体在15个基因上的单体型分型情况。通过比较发现, 当某个基因中SNP数量过多时, 个体分型种类十分复杂, 不能用于亲子鉴定, 因此我们选择SNP数量较少的基因msi2尝试进行单体型分型。在5尾二倍体亲本中, 该基因的SNP总共出现了10种分型, 也就是说, 在5个亲本中出现了10个不同的等位基因类型。在正常情况下, 如果不考虑重组以及各种偏差, 任何两个亲本得到的后代都应该是这10个等位基因的组合, 可以被明确地鉴定其等位基因来自哪两个亲本。然而, 通过群体遗传学推断, 在171尾子代中共检出42种分型, 出现了34种亲本并不存在的分型, 并且有一个母本(2#)的两种分型还不包含在其中。
3. 讨论
3.1 标记获取方法
目前标记的获取主要有三种策略: (1)从已经报道的多态性标记位点中获得[32, 41]; (2)选取适当数量(通常小于100尾)的个体数据用于测试标记多态性[12, 42, 43]; (3)使用全部亲本子代组成的群体进行标记筛选[25, 44]。本研究所采用的方法为第二种, 并且考虑到重组和变异的频率不可能很高, 子代的绝大部分标记均与其亲本一致, 因此我们用于获取标记的个体为全体亲本, 不包括子代个体。在鱼类育种研究中, 通常是很有限的亲本产生大量的子代。在亲子鉴定过程中, 我们只需要通过数量有限的亲本获取少量标记, 即可从大量的子代中获取出必要的信息, 这种做法具有快速和低成本的优点, 非常有利于大规模的亲子鉴定。
3.2 单体型/微单体型标记的分型方法比较
本研究比较了基于群体遗传推断的方法和基于个体序列组装的方法。前者使用的算法大多为EM算法或其他概率算法, 核心为参数优化, 从理论本身而言, 需要大样本量来进行推断, 对于样本量较少而SNP位点较多的群体分型结果不准确[31]。依据孟德尔分离定律与自由组合定律, 理论上绝大多数子代的分型应与其对应的亲本相一致, 然而在本研究中该方法的分型结果与亲本的实际分型情况相差很大, 因此我们没有使用这些分型数据进行亲子鉴定。出现这样亲子分型差异较大的情况, 说明对于这种方法来说, 包含171尾子代个体的群体样本量依然太小, 导致进行概率计算时无法获得准确的估计, 从而产生了错误的分型结果。可见使用群体遗传学方法进行单体型分型对于样本数据量有很高的要求, 在应用中有明显的局限性。
相比之下, 利用测序数据直接进行单体型或微单体型组装的方法不仅更为准确地从亲本中得到了各个标记的多种分型, 也能从子代中找到这些分型, 从而顺利完成亲子鉴定过程。这种方法的主要劣势在于易受到单个位点测序深度和测序错误的影响[36]。在本研究中, 子代测序深度为15X, 在某些SNP位点上测序深度不足, 导致无法获取某些微单体型的分型。不过, 在实际应用中这也不会成为一个问题, 因为在经通过亲本的测序数据选定标记之后, 只需要在子代中扩增这些微单体型标记, 直接测序即可得到其准确的分型, 而不需要进行高成本的基因组重测序与序列组装。此外, 目前靶向捕获基因组联合二代测序技术已经得到了广泛应用[45], 同样可以用于在大量的子代群体中测序少量的标记序列。很显然, 在高通量测序技术已经普及的背景下, 基于序列组装的方法更加适合于鱼类亲子鉴定的工作。
3.3 MH在亲子鉴定中的应用
本研究比较了用MH与SSR进行亲子鉴定的结果, 并未得到完全的一致, 可能有两方面的原因。首先, 某些个体测序深度不足, 导致无法分型, 这已在上文进行讨论。其次, 各标记多态性不同, 导致亲本区分度不同。从图 2和表 2来看, 一致率低的基因往往只有极少或根本不存在SNP密集分布区域, 导致这些基因的绝大多数MH分型种类也较少, 大量亲本为纯合子, 对各亲本的区分度不足, 而目前常用的CERVUS 3.0软件倾向于选择纯合子亲本作为亲子鉴定的输出结果[46], 因此, 对于这类基因, MH亲子鉴定得到的亲本往往是纯合子, 而与真实亲本对可能有较大误差, 最终影响亲子鉴定结果的准确性。相反, 一致率高的基因大多存在若干SNP分布密集的区域且有效MR数较多, 即使单个基因近似连锁遗传, SNP密集的MH具有高多态性, 使得此基因MH标记总信息熵高, 可弥补其他MH区分度低的缺陷, 从而保留较高亲本区分度。此外, 在这些MH上亲本大多为杂合子, 因此可以极大提升亲子鉴定效果, 最终亲子鉴定一致率较高(图 4B)。最后, MH标记内部也可能存在的重组问题, 虽然这种可能性很小, 但一旦发生, 子代分型结果便无法与其真实亲本对完全对应, 从而导致亲子鉴定结果出现误差, 这种情况在SSR标记中也存在。为尽可能减少上述因素的影响, 本研究使用了高多态的分子标记及冗余标记, 其中高多态的分子标记用于提升标记区分度, 冗余标记用于矫正测序深度和重组带来的分型误差, 最终亲子鉴定一致率得到了提升(表 3)。
MH标记应用于亲子鉴定的优势在于此类标记易于获取、分型及筛选, 如果结合靶向测序就能够以极低的成本高效而准确地完成子代的分型与亲子鉴定; 其劣势则在于鉴定能力严重依赖于MH标记的多态性, 而且使用全基因组重测序数据分析时, 有些标记可能会受局部测序偏低的影响, 此外, 标记内重组也影响亲子鉴定效果。因此, 我们的方法首先根据亲本序列对目标区域的SNP密度进行评估, 筛选出高多态性的MH分子标记, 从而提升所用标记的分辨能力; 加入冗余标记则可以尽可能地减少测序深度低和标记内重组带来的影响; 如果对目标基因或片段进行靶向测序, 就能够完全排除局部测序深度低的干扰。
3.4 前景展望
虽然本研究的范例中仅从15个基因序列里筛选了亲子鉴定的标记, 但对于有参考基因组的物种, 该方法完全可以在全基因组范围内进行微单体型标记的获取与分型。通过计算这些微单体型信息熵值以筛选信息熵最高的微单体型标记, 提升标记的多态性和分辨能力, 可以用于个体鉴定、亲子鉴定, 以及更广泛的亲缘关系鉴定, 甚至还可将其应用于经济性状的关联分析中, 作为全基因组选择育种的分子标记。
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