三种水鳖科沉水植物释放的脂肪酸类化感物质的分离与鉴定
ISOLATION AND IDENTIFICATION OF ALLELOPATHIC FATTY ACIDS EXUDED FROM THREE SUBMERGED HYDROCHARITACEAE SPECIES
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摘要: 沉水植物是水生态系统的重要组成部分,在维持水生态系统结构和功能方面具有重要作用[1],其中的一个重要机制就是通过释放化感物质抑制藻类生长,从而保持水体的清水稳态[2]。
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表皮分化复合体(Epidermal differentiation complex, 缩写为EDC)基因最初在人类基因组上发现, 呈簇状分布于染色体1q21上一个2 Mb的区域, 包含多个编码结构、调控蛋白的基因[1—3]。EDC基因对于角质形成细胞分化和角质层特性至关重要[4], 主要包括四类基因家族: 编码S100钙结合蛋白A (S100 calcium binding protein A, S100A)、肽聚糖识别蛋白(Peptidolycan recognition protein, PGLYRP)、简单表皮分化复合体(Simple epidermal differentiation complex, SEDC)和S100融合蛋白(S100-fused type proteins, SFTP)的基因家族。SEDC是单外显子基因, 编码小脯氨酸富含蛋白(Small proline-rich protein, SPRR)、外皮蛋白(Involucrin, IVL)和兜甲蛋白(loricrin, LOR)等。SFTP基因具有多个编码蛋白的外显子, 编码角质保护蛋白(cornulin, CRNN)、丝聚蛋白(Filaggrin, FLG)、毛角质透明蛋白(Trichohyalin, TCHH)和晚期角化包膜蛋白(Late cornified envelope, LCE)等[5—7]。
EDC基因相继在脊椎动物不同分支中(哺乳类[3, 8, 9]、鸟类[10, 11]、爬行[11—15]、两栖[16])被发现。哺乳类、鸟类、爬行类、两栖类的S100A家族高度保守, 鸟类不存在PGLYRP3基因。对于SEDC家族, 不同于其他脊椎动物, 哺乳动物缺乏β角蛋白基因(Beta-keratin)[3, 8], 哺乳类、鸟类及爬行动物都含有谷氨酰胺基序的表皮分化蛋白基因(Epidermal differentiation protein containing a glutamine (Q) Motif, EDQM)。爬行动物的SEDC家族较为保守, 蜥蜴、鳄鱼、蛇都不存在龟鳖特异的富含脯氨酸、半胱氨酸和缬氨酸的表皮分化蛋白基因(Epidermal differentiation protein rich in Proline, Cysteine and Valine, EDPCV)[13—15]。与龟鳖、鳄鱼相比, 蜥蜴和蛇缺失了富含芳香氨基的表皮分化蛋白基因(Epidermal differentiation protein rich in Aromatic Amino, EDAA)[11, 12]。两栖动物的SEDC家族仅由几个SEDC1、SEDC2基因组成[16]。SFTP家族在脊椎动物中存在物种特异性, 哺乳动物中除含有CRNN基因外, 还有FLG、TCHH、LCE等基因[3, 8, 9]。绿蜥蜴中缺失了CRNN[11], 蛇类编码支架蛋白的基因(Scaffoldin, SCFN)出现了两个拷贝[13]。
EDC基因调控羊膜动物角质形成细胞的分化, 对其鳞片、喙、爪子、皮肤等组织的发育发挥着至关重要的作用[17, 18]。研究表明EDC 基因编码蛋白的氨基酸组成会造成不同皮肤附属物物理特性的差异[12, 13, 19]。在羽毛、毛发和爪子中, 富含半胱氨酸的蛋白质会形成更多的二硫键从而增加其硬度和强度[20, 21]。甘氨酸和脯氨酸有助于形成柔韧的螺旋结构, 提高皮肤的柔韧性和弹性[17, 21]。酪氨酸和苯丙氨酸等芳香族氨基酸在角质层蛋白中含量较高, 通过形成复杂的蛋白质网络, 增强外表皮的耐磨性和抵抗力[21, 22]。丝氨酸和丙氨酸亲水性有助于蛋白质保持水分, 从而提高外表皮和角质层的保湿能力[7, 11, 21—24]。因此分析EDC基因编码蛋白的氨基酸组成有助于解析其功能及特性。
甲壳(背甲、腹甲)使龟鳖在脊椎动物中独树一帜, 然而龟鳖的甲壳由基本的骨骼、真皮和表皮三个部分组成, 这暗示其遗传基础是保守的。龟鳖甲壳骨骼相关的进化和发育已经被广泛、深入地研究, 然而其甲壳表皮结构进化的遗传分子基础研究才开始[12, 25—29]。龟鳖甲壳的最外层表皮具有角质化纹理结构, 根据其骨化、角质化程度高低可分为硬壳、软壳和棱皮[30—32]。尽管龟鳖表皮分化的分子机制尚未完全厘清, 但可以通过与其他羊膜动物比较分析推断出龟鳖甲壳特征是角质形成细胞分化过程特定适应的结果[11]。表皮的主要细胞类型是角质形成细胞, 它不仅形成角质层, 还形成各种皮肤附属物[33]。表皮组织的发育和分化与EDC基因的演化和特定的表达调控模式密切相关[23, 33—35]。因此发掘龟鳖EDC基因的序列特征和进化有助于解析其甲壳表皮特征的遗传基础和演化历史。
目前, EDC基因仅在少数龟鳖物种中进行了鉴定、分析[12], 尚缺乏对EDC基因序列特征和进化水平在不同龟鳖类群的系统性比较分析。本研究对28个龟鳖EDC基因进行了比较基因组学鉴定, 染色体定位、氨基酸含量、结构域、蛋白空间结构分析和演化历史的重塑, 为进一步研究EDPCV基因在龟鳖中的作用提供了数据基础和理论依据。
1. 材料与方法
1.1 EDC蛋白参考序列收集和同源预测
搜集人(Homo sapiens)、家鸡(Gallus gallus)、锦龟(Chrysemys picta bellii)、绿蜥蜴(Anolis carolinensis)、缅甸蟒(Python bivittatus)、短吻鳄(Alligator mississippiensi)EDC基因蛋白序列作为参考序列, 用于基因同源预测[11—15]。NCBI数据库下载已公布的28个龟鳖物种基因组序列。这些物种覆盖鳖科(Trionychia, n=4)、地龟科(Geoemydidae, n=4)、陆龟科(Testudinidae, n=4)、泽龟科(Emydidae, n=6)、平胸龟科(Platysternidae, n=1)、海龟科(Cheloniidae, n=3)、鳄龟科(Chelydridae, n=2)、侧颈龟科(Pelomedusoides, n=2)和蛇颈龟科(Chelidae, n=2)。
将参考蛋白序列与龟鳖基因组进行比对[36] (E<10–5), 过滤掉低质量序列(alignRate<50%, identity<40%); solar[37](v0.9.6)连接比对结果, 对其上下游各延伸5 kb, 进行GENEWISE[38]精细比对, 最终通过手动检查、筛选获得正确的同源基因序列。
对28个龟鳖鉴定的EDC蛋白序列进行统一命名, 其命名方式为由表皮分化(Epidermal differentiation, ED)和描述氨基酸组成或编码蛋白质中特定氨基酸序列基序组成[11]。
1.2 基因染色体定位
分别使用R包gggenes[39]和pheatmap[40]对EDC基因进行可视化展示。
1.3 序列分析
龟鳖物种间亲缘关系来源于已发表的系统发生树[41], 利用python脚本对蛋白序列进行氨基酸组成计算, 利用R的wilcox.test函数进行秩和检验, 并筛选出EDC蛋白序列具有显著差异的类群和氨基酸。并用R包reshape2[42]和ggplot2[43]对每个EDC蛋白序列氨基酸进行可视化展示。
利用AlphaFold2[44]进行蛋白空间模型预测, PYMOL[45]进行可视化展示。通过MEME[46]软件对蛋白序列进行motif分析, 利用rpsblast[47]进行蛋白结构域预测, 并利用tbtools[48]进行可视化展示。
1.4 进化分析
使用mafft[49]软件进行EDC蛋白序列的多序列比对, 并使用Jalview[50]进行序列比对结果可视化。利用iqtree[51]设置参数(Ultrafast bootstrap=1000), 以鸡的S100A11基因作为外群并且使用最佳模型VT+F+R7对EDC基因进化树进行构建, 并利用ITOL[52]进行可视化展示。
2. 结果
2.1 龟鳖EDC基因呈现拷贝多样性并存在特有的EDPCV基因
为了解析龟鳖EDC基因是否具有保守性和类群特异性, 利用已发表的EDC基因蛋白序列(人、家鸡、锦龟、绿蜥蜴、缅甸蟒、短吻鳄)作为参考, 对囊括9个科的28个龟鳖基因组序列进行基因同源预测, 鉴定S100A12和S100A11基因间的EDC基因集。龟鳖EDC基因具有和外群物种(家鸡、鳄鱼、蜥蜴、蛇)相同的四类基因家族(S100A、PGLYRP3、SEDC、SFTP)且成簇分布(图 1)。龟鳖的S100A、PGLYRP3和SFTP基因家族成员高度保守, 并未出现基因的复制和丢失。家鸡和绿蜥蜴分别丢失了PGLYRP3和CRNN基因, 这和之前的报道一致[11]。龟鳖EDC基因的多样性主要来源于SEDC基因家族, 其中五种不同类型的基因组成占据了主体, 包括EDQM、EDAA、EDP、EDPCV和β角蛋白基因(图 1)。EDQM、EDAA和EDP基因在龟鳖物种间具有相似的拷贝数, 其中EDAA(n≈9)和EDP (n=3)基因的拷贝数高于家鸡(n=5, 1), 表明这两类基因在龟鳖祖先发生了扩张。值得一提的是, 仅有龟鳖EDPCV在外群不存在对应直系同源基因, 这说明EDPCV基因起源于龟鳖的共同祖先。龟鳖SEDC基因家族最多拷贝来源于β角蛋白基因(n=2—125), 并呈现物种特异性。虽然存在零星的物种特异性基因丢失, 龟鳖SEDC基因家族的其他基因成员(例如EDKM、EDQL、EDYM1和EDPE)均高度保守(图 1)。综上, 龟鳖EDC基因具有和其他爬行动物相同的四类基因家族, SEDC基因家族成员通过多次串联重复事件, 实现基因扩张。此外, 龟鳖EDC基因存在龟鳖特有的EDPCV基因。
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图 1 龟鳖与其他爬行动物EDC基因的基因组分布左图为龟鳖和其他爬行动物的物种树; 右图显示了表皮分化复合体(EDC) 基因的组成; 着色的矩形代表 EDC 基因的不同成员; 连接矩形的实线代表基因间的物理基因组连锁; 矩形中的数字表示基因数量Figure 1. Genomic distribution of EDC genes in turtles and other reptilesThe left side illustrates a species tree of turtles and other reptiles, while the right side displays the distribution of the Epidermal Differentiation Complex (EDC) genes. Colored squares represent the identified EDC genes, and solid lines connecting the gene boxes indicate physical genomic linkage. The number in the rectangle indicates the gene numbers2.2 龟鳖SEDC和SFTP蛋白氨基酸组成具有类群特异性
为了厘清龟鳖EDC蛋白的氨基酸组成及特征, 对其四类基因家族成员的氨基酸含量进行计算和比较。龟鳖的S100A、PGLYRP3和SFTP家族成员间的氨基酸组成保守, SEDC家族的氨基酸组成高度多样化。龟鳖SEDC蛋白氨基酸组成中富含甘氨酸(G)和丝氨酸(S), 或半胱氨酸(C)和脯氨酸(P), 或赖氨酸(K)和谷氨酰胺残基(Q)。其中EDPQ和EDPCV的半胱氨酸(C)和脯氨酸(P)的总含量超过了氨基酸残基总数的50%, LOR的甘氨酸(G)和丝氨酸(S)的总含量超过了氨基酸残基总数的50% (图 2A)。富含甘氨酸/丝氨酸(G/S)的基因分布在EDC的左半区域, 而编码富含半胱氨酸/脯氨酸(C/P)的基因则集中在EDC的右半区域(图 2B), 这表明EDC基因是通过串联重复事件产生的。EDQM、LOR和SFTP (SCFN 、CRNN)蛋白序列中部的氨基酸序列以重复序列为主, 其中鳖科LOR比龟科具有更长的重复序列(图 2C), 这可能来源于染色体交叉过程中的不等互换。
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图 2 龟鳖EDC蛋白氨基酸组成A. 龟鳖不同物种 EDC 蛋白的氨基酸组成; B. 龟鳖EDC基因氨基酸含量均值百分比趋势图; 蛋白展示顺序和图 1中EDC基因分布顺序一致; C. 鳖、龟SEDC示例(EDQM1和LOR)蛋白氨基酸序列, 重复序列用蓝色矩形标记; D. 不同龟鳖科间 CRNN 蛋白氨基酸组成的比较; 统计显著性为: 0.01<*P<0.05Figure 2. Amino acid contents of turtle EDC proteinsA. The diagram shows the amino acid contents of EDC proteins across turtle species; B. The average distributions of amino acid content in turtles. The protein data are shown in the order of the corresponding genes in the EDC (Fig. 1); C. Amino acid sequences of exemplary SEDC proteins (EDQM1 and LOR) from softshell and hardshell turtles are shown, with sequence repeats highlighted in blue rectangles; D. The distribution of amino acid content of CRNN protein sequences across various turtle families; The level of significance: 0.01<*P<0.05龟鳖甲壳存在硬壳(例如地龟科、陆龟科和泽龟科)软壳(鳖科)和棱皮(海龟科为代表)三种类型, 这提示其表皮的遗传基础可能存在类群差异。相对地龟科、泽龟科和海龟科, 鳖科的EDQL蛋白序列显著富含精氨酸(R)。相对地龟科、陆龟科, 鳖科的EDYM1蛋白序列显著富含甘氨酸(G)。相对地龟科、陆龟科和泽龟科, 鳖科的EDAA蛋白序列显著富含半胱氨酸(C)、丝氨酸(S), 鳖科的CRNN蛋白序列显著富含谷氨酸(E)、组氨酸(H)和精氨基酸(R), 但谷氨酰胺残基(Q)含量较低(图 2D)。相对泽龟科, 鳖科的EDPE蛋白序列显著富含苏氨酸(T); 相对地龟科和陆龟科, 鳖科的SCFN蛋白精氨酸(R)含量较低; 地龟科的EDPL1比鳖科显著富含赖氨酸(K)。这些结果表明鳖科作为软壳类群在SEDC (EDQL、EDYM1、EDAA)和SFTP (CRNN、SCFN)蛋白氨基酸含量不同于硬壳、棱皮类群。
相对地龟科、陆龟科和泽龟科, 海龟科的EDKM蛋白序列显著富含异亮氨酸(I)和精氨酸(R); 地龟科、陆龟科和泽龟科的EDKM相对海龟科显著富含精氨酸(R)。相对陆龟科、海龟科的EDKM和EDQL蛋白序列分别显著富含亮氨酸(L)和苏氨酸(T); 相对泽龟科, 海龟科EDPE和EDPQ蛋白序列分别显著富含谷氨酸(E)、缬氨酸(V)和赖氨酸(K)。由此可见, 海龟壳的SEDC (EDKM、EDQL、EDPE、EDPQ)蛋白氨基酸含量不同于硬壳类群。此外, 相对陆龟科, 地龟科的EDPL1显著富含谷氨酸(E);泽龟科的EDPL1分别比海龟科、陆龟科分别显著富含谷氨酸(E)和苏氨酸(T)。
综上, 龟鳖SEDC蛋白氨基酸组成高度多样化, SEDC和SFTP蛋白氨基酸含量存在类群(硬壳、软壳、棱皮)特异性, 这支持了龟鳖甲壳表皮结构的多样性。
2.3 龟鳖SFTP蛋白结构域保守
为了探明龟鳖S100A、PGLYRP3和SFTP功能域和蛋白空间结构的保守性, 选取龟鳖每个科中基因质量最好的序列进行分析比较。龟鳖S100A11和SFTP家族成员(SCFN和CRNN)功能域高度保守, 都具有相同S100结构域的α螺旋结构(图 3A), 支持了EDC基因起源于S100A基因的假说。值得一提的是, 所有SEDC家族成员并不存在S100结构域的α螺旋结构。此外, 基序(motif)分析表明龟鳖S100A和SFTP家族成员具有高度保守的motif序列, 仅鳖科的PGLYRP3缺失了motif3 (图 3B)。综上, 龟鳖S100A和SFTP功能域和蛋白空间结构高度保守, 仅PGLYRP3的motif3存在鳖科特异性丢失。
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图 3 龟鳖目SFTP的空间结构和PGLYRP3的motif分析A. 鳖科和陆龟总科SFTP和S100A11蛋白的空间结构, 红色α螺旋标记为S100结构域; B. 矩形标记为 PGLYRP3蛋白motif区域Figure 3. Spatial structure of SFTP and motif analysis of PGLYRP3 in turtlesA. The spatial structures of the SFTP and S100A11 proteins in the families of Trionychia and Testudinoidea, with the red α-helix labeled as the S100 domain; B. The rectangle marks the protein motif regions of the PGLYRP32.4 龟鳖特有的EDPCV起源于EDP1, 串联重复实现扩张
为了揭示龟鳖SEDC基因家族的演化历史, 我们选取家鸡S100A11定根并对所研究的28个龟鳖SEDC基因进行了系统发育分析。龟鳖SEDC家族成员基因都形成了独立的单系群(Monophyletic group, 包含一个共同祖先及其所有后代), 这说明龟鳖SEDC家族基因成员具有相同的祖先起源并保守(图 4A)。其中LOR、EDQL、EDWM和EDQM系统发育分支构成单系群(图 4A), 并且在染色体上依次分布(图 1A), 其共同祖先起源并通过串联复制实现。值得一提的是, 龟鳖特有的EDPCV基因和EDP1基因构成姐妹分支, EDPCV很可能起源于EDP1基因。多序列结果表明EDPCV和EDP1具有最高的序列相似性, EDP1的多个脯氨酸(P)突变为半胱氨酸(C)和缬氨酸(V)。综上, 本文推断龟鳖特有的EDPCV基因起源于EDP1基因的复制, 在新功能化(Neofunctionalization)作用下发生氨基酸突变(富含半胱氨酸和缬氨酸, 前者形成更多的二硫键, 增加硬度和强度), 并通过基因的串联复制实现EDPCV基因的扩张(图 4B), 进而实现龟鳖表型创新(甲壳、表皮角质化等)。
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图 4 龟鳖目SEDC基因系统发育分析及演化A. 龟鳖SEDC基因系统发育树; 颜色标注不同家族成员; B. 龟鳖EDPCV基因起源及多样化模型Figure 4. Phylogenetic analysis and the evolution of SEDC in turtlesA. Phylogenetic tree of SEDC genes in turtles; Colors indicate SEDC subfamilies; B. A scenario for the origin and diversification of EDPCV in turtles3. 讨论
3.1 龟鳖甲壳形态演化与EDC基因簇扩张的关系
本研究结果表明龟鳖独特形态(甲壳)的演化涉及表皮分化基因的特定适应, 这些基因位于羊膜动物特有EDC基因簇。在龟鳖动物演化过程中, EDQM、EDAA、EDP、β角蛋白基因和龟鳖特有的EDPCV通过串联复制实现扩张(图 1)。这些发生扩张的基因在不同发育时期的甲壳(背甲和腹甲)组织中存在差异表达(数据未展示)。本文推断这些在龟鳖扩张的基因可能通过新功能化作用实现组织、时空特异性表达, 从而促进了甲壳(例如盾片)的产生。此外, 在龟鳖发育过程中, 龟鳖特有的EDPCV和EDC其他家族成员的表达时序, 调控关系对于解析甲壳的发生、发育至关重要, 也可成为新基因—新表型研究的范式。
3.2 龟鳖EDC蛋白的氨基酸组成特征与表皮结构的多样性
EDC编码表皮角质形成细胞的结构蛋白[1, 5, 33], 其中SEDC 编码的蛋白质作为皮肤表面机械弹性结构的交联成分发挥其功能[23, 33]。EDC家族成员编码蛋白的相对丰度和分子相互作用类型可能调节角质化产物的物理、化学性质, 例如柔韧的角化层和坚硬的背甲盾片等[11]。本研究结果表明发生扩张的SEDC家族成员显著富含不同的氨基酸成分, 例如含多聚谷氨酰胺(Q)的EDQM、富含脯氨酸(P)和半胱氨酸(C)的EDPCV、富含芳香族氨基酸的EDAA。这些蛋白家族特异的序列特征可能促进与角化角质形成细胞结构蛋白间不同类型的相互作用[53]。谷氨酰胺和半胱氨酸(在EDQM 和 EDPCV中)是实现EDC蛋白分子间交联的主要部位, 分别通过转谷氨酰胺化和二硫键作用[7, 33, 54]。富含半胱氨酸的蛋白质通过形成更多的二硫键, 从而提高羽毛、毛发和爪子的硬度和强度[20, 21]。LOR和EDQM序列中位于转谷氨酰胺化位点间的甘氨酸可能利于蛋白序列长度的变化, 从而实现角质形成细胞角质化过程中细胞蛋白包膜的压缩[33]。本研究发现相比地龟科、陆龟科和泽龟科, 鳖科的EDAA蛋白序列具有显著更高的半胱氨酸含量, 并且EDQM和LOR的氨基酸重复序列存在龟、鳖差异(图 2C)。此外, 隶属于SEDC家族的EDQL、EDYM1、EDKM、EDPE、EDPQ和EDPL1也存在类群(软壳、硬壳和棱皮)特异的氨基酸富集情况。上述结果支持了龟鳖甲壳表皮结构的多样性, 虽然缺乏直接的实验证据。
SFTP基因簇编码的蛋白在表皮对环境的屏障中起着至关重要的作用, 存在于哺乳动物、爬行动物、鸟类和现存两栖动物的共同祖先中[6, 11]。SFTP基因在其他类群中经历了不同程度的扩张和丢失。在鲸豚类中海豚保留了LCE和FLG基因[9], 而鲸鱼的LCE和FLG发生了丢失[8]。在爬行动物中, 绿蜥蜴丢失了CRNN[11], 而蛇类SCFN出现了两个拷贝[13]。龟鳖SFTP不存在种类和拷贝的差异(图 1), 这表明在演化历程中的保守性。SCFN基因主要在鸡胚胎皮肤的表皮层中表达, 也在指甲中表达[55]。SCFN蛋白在鸡胚胎的喙、趾、皮肤和舌头中表达[55, 56]。CRNN蛋白主要在表皮的颗粒层、毛囊的内根鞘以及食管上皮组织中表达[55, 57]。此外, 不含角质形成细胞的组织缺乏CRNN和SCFN表达[55, 57]。CRNN的中心结构域含有高含量的谷氨酰胺, 成为其在角质形成细胞角化过程中的转谷氨酰胺靶标[55]。同时, 在表皮分化过程中, 精氨酸脱亚胺酶会催化蛋白质的翻译后修饰, 从而生成游离的氨基酸, 以维持角质层细胞的稳定性和屏障功能[58]。本研究发现鳖科SCFN的精氨酸(R)含量与地龟科、陆龟科存在显著差异。鳖科CRNN的谷氨酰胺含量与地龟科、陆龟科和泽龟科存在显著差异(图 2D)。SFTP蛋白序列在鳖科和龟科之间也存在重复序列差异。这些结果提示SFTP蛋白氨基酸含量的差异可能导致了龟、鳖表皮结构的不同。
3.3 EDC基因的演化机制
以往假说认为, 在原始EDC中相邻S100A和PGLYRP基因经历了一系列融合、复制、外显子缺失、内含子缺失及编码序列末端的变化, 最终形成了SEDC、SFTP和EDKM基因。随后SEDC和SFTP基因经历了广泛的基因复制和序列修改, 生成了序列高度多样化的蛋白质, 其中只有少数序列元件在部分蛋白中保留[11]。本研究发现起源于EDPCV是龟鳖特异的, 并且起源于龟鳖共同祖先。系统发育分析和多序列比对证实EDPCV起源于EDP1, 脯氨酸(P)突变为半胱氨酸(C)和缬氨酸(V), 最终通过串联复制实现基因扩张。本研究印证了EDC起源的假说——“复制、突变、串联复制”, 也为龟鳖的表型创新研究提供了靶标。
综上, 本研究通过比较基因组学揭示了龟鳖表皮的演化与EDC的串联复制扩张, 氨基酸富集密切相关。EDC类群特异的基因组成变化促进了龟鳖表皮对不同环境和生活方式的适应性进化。龟鳖特异EDPCV基因的起源和演化历史的重塑将为甲壳表皮结构的遗传分子相关研究提供理论基础和参考。
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