CLONING, MOLECULAR CHARACTERISTIC AND PHYLOGENETICS OF HEMOGLOBIN GENES IN CULTER ALBURNUS
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摘要: 研究通过克隆翘嘴鲌(Culter alburnus)血红蛋白基因, 分析血红蛋白的分子特征及系统进化, 探讨鱼类耐低氧的可能成因。研究克隆了翘嘴鲌血红蛋白家族中Hba1/2和Hbb1/2 cDNA序列, 翻译后分别得到143、143、147和147个氨基酸。蛋白二级结构分析表明Hba1/2和Hbb1/2蛋白分别包含7和8个螺旋域、14和13个α1β2结合残基、12和16个亚铁血红素结合残基, 均有16个α1β1结合残基, 只有Hba1/2蛋白具有6个Bohr效应残基。与两栖类和哺乳类相比, 鱼类Hba和Hbb蛋白功能域上分别有10和5个氨基酸残基替换位点, 这很可能是为了使其适应水中的低氧环境。而耐低氧与不耐低氧鱼类相比, 其蛋白二级结构并未发现一致性的替换, 这表明鱼类的耐低氧特征很可能是受到上游信号通路的调控。通过系统发育关系表明Hba1/2和Hbb1/2基因亚型的复制事件很可能发生在脊椎动物全基因组复制之后且硬骨鱼类全基因组复制事件之前。值得注意的是在系统进化树上, 与其他鱼类相比翘嘴鲌和斑马鱼在Hba1/2和Hbb1基因上有更近的亲缘关系, 这很可能是由于其同属鲤形目且均不耐低氧所致。研究首次克隆了翘嘴鲌血红蛋白家族基因, 分析其分子特征及与其他物种的系统发育关系, 并探讨了鱼类耐低氧的可能成因, 为鱼类的耐低氧生物学研究提供了理论基础与潜在方向。Abstract: Hemoglobin is one of the most important proteins for aerobic metabolism in vertebrate. The studies of Hb are more in Mammalia, but less in fishes with low-oxygen environment. This study cloned Hba1/2 and Hbb1/2 cDNA sequences of Culter alburnus (C. alburnus) hemoglobin, which encode 143, 143, 147 and 147 of amino acids, respectively. The second structure analysis of proteins indicated that Hba1/2 and Hbb1/2 included 7 and 8 helical regions, 14 and 13 α1β2 interfaces, 12 and 16 heme bindings, 16 and 16 α1β1 interfaces, respectively, and 6 Bohr effect residues only for Hba1/2. Compared with amphibians and mammalia, there were 10 and 5 amino acid substitutions in fishes of Hba and Hbb functional domains, which may be used to adapt to hypoxia. However, compared with tolerant and intolerant hypoxia fishes, we did not find any coherent substitution in the second structure of proteins, indicating that the tolerant hypoxia trait of fish may be regulated by upstream signal pathways. The phylogenetic relationship showed the duplication events of Hba1/2 and Hbb1/2 isoforms may occurre after vertebrate and before teleost of whole-genome duplications. Interestingly, in the phylogenetic trees, the genetic relationships of C. alburnus and Danio rerio of Hba1/2 and Hbb1 were closer than those of C. alburnus and other fishes, probably because both C. alburnus and Danio rerio belong to Cypriniformes and intolerant to hypoxia. This study cloned Hba1/2 and Hbb1/2 cDNA sequences of C. alburnus hemoglobin, analyzed molecular characteristics and phylogenetic relationships with others, and discussed the possible causes of fish tolerance to hypoxia. These findings provide a theoretical basis and potential direction for fish tolerant hypoxia biology.
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随着野生渔业资源的日益枯竭, 以及我国内陆淡水池塘养殖的快速发展, 高密度放养成为当前池塘主要养殖方式, 然而由于养殖鱼类活动空间拥挤、范围小, 游泳运动减少, 造成商品鱼质量严重下降, 例如土腥味严重、脂肪堆积、肌肉松弛、鱼体免疫力下降及经济效益低等问题[1]。同时消费者对鱼类品质的要求不断提高, 流水养鱼这种不仅能够提高渔业产量又能改善肌肉营养品质的生态养殖模式正越来越受到人们的关注[2]。池塘内循环流水养殖(Inner-Pond Raceway Aquaculture, IPRA), 简称“跑道养殖”, 于2015年引入我国, 是对传统常规池塘养殖模式进行工程化改造, 形成高密度养殖水槽和生态净水区相结合的养殖系统, 是一种新型的生态高效环保养殖模式[3]。IPRA作为一种有效收集养殖对象残饵粪便和以养殖用水净化后循环利用为主要特征的高效养殖模式, 具有节水、环保、高产、智能化的特点, 符合绿色渔业发展的要求。截至2021年仅浙江省已建成2000余条的IPRA养殖水槽, 推广面积近10 km2 [4]。目前, 草鱼(Ctenopharyngodon idella)、花鲈(Lateolabrax maculatus)、大口黑鲈(Micropterus salmoides)、黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)、罗非鱼(Oreochromis mossambicus)及鲫(Carassius auratus)等多个品种已在国内开展了IPRA养殖试验[4], 相关研究主要总结了水质改善[5]、设备改进[6]、营养成分[7]和市场效益[8]等, 而有关水流诱导鱼类运动引起鱼类生长代谢的基础理论研究相对较少。因此, 探索水流因子对养殖对象生长性能、抗氧化能力、生理生化、能量代谢和组织结构等指标的影响, 为IPRA甚至流水养鱼提供重要的技术理论支撑。
经笔者团队近几年的生产实践, 已证实大口黑鲈是适宜IPRA系统养殖的主要品种之一, IPRA的氮磷排放量及排污系数是传统池塘养殖(UPA)四倍以上, 且IPRA净利润率为(53.96±2.21)%, 显著高于UPA(48.04±2.05)%, 取得了较好的生态和经济效益[8]。目前该养殖模式仍处于探索起步阶段, 许多参数都还处于空白阶段, 而本研究前期养殖试验发现, IPRA养殖系统中当流速控制在(0.3±0.05) m/s时, 其养殖的大口黑鲈相对于UPA能增强能量代谢从而有效抑制大口黑鲈内脏脂肪的沉积。相关研究亦表明适当的游泳运动训练可以增强心血管功能, 促进鱼类生长, 改善其生理代谢机能, 提高鱼类生长率等[6], 但运动量过大又会导致代谢紊乱及免疫能力下降, 增加机体的易感性, 影响机体健康[9], 因此急需探索大口黑鲈最适水流速度。
本项目拟通过开展IPRA模拟系统中不同流速大口黑鲈养殖的试验研究, 探明水流因子对大口黑鲈生长指标、体营养成分、形体指标、抗氧化指标、代谢指标及组织形态的影响, 探讨IPRA大口黑鲈养殖最适流速, 为IPRA大口黑鲈健康养殖提供技术支撑。
1. 材料与方法
1.1 实验地点与设施
在浙江省湖州市南浔区勤劳村现代渔业园区内选择1个水域面积约2.2 ha的IPRA模式池塘, 池塘安装有4条流水养殖槽, 生态净水区投放鲢(Hypophthalmichthys molitrix)和鳙(Aristichthys nobilis)等滤食性鱼类, 水面利用生态浮床种植铜钱草(Hydrocotyle vulgaris)和狐尾藻(Myriophyllum verticillatum L.)等耐低温水生植物, 并配有4台水车式增氧机(2.0 kW·h/台), 岸边靠近水槽的一侧建有1个集污池。在IPRA水槽进水端一侧放置4套自主研制的模拟水槽装置, 如图 1所示, 该套装置主要包括3条水槽、变频水泵、整流栅、PVC漂浮管及盖网。前期生产中IPRA养殖调查分析结果显示, 前端流水槽中推水速度基本处于0.3—0.4 m/s, 在该流速下大口黑鲈具有较高的生长速度, 因此参照此流速, 本试验设置3个水流速度处理组, 分别为低流速0.2 m/s (L)、中流速0.4 m/s (M)和高流速0.6 m/s (H), 另外设置空白对照组, 即静水组(C)。其中每条养殖水槽的水深为0.5 m, 长1.2 m, 宽0.3 m, 养殖体积为0.18 m3。
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图 1 养殖模拟装置图A. 实际养殖装置; B. 养殖装置剖面图Figure 1. Farming simulation device drawingA. actual breeding device; B. profile of breeding device1.2 养殖管理
模拟水槽投放鱼苗时间与IPRA系统中投放鱼苗保持一致, 即在12条模拟水槽内放养规格为(8.13±0.82) g的在IPRA系统中已驯食好的健康大口黑鲈苗种, 每条水槽初始投放苗种22尾, 未开启变频水泵, 以适应模拟水槽装置。另外可能由于本模拟装置为白色, 与IPRA系统养殖水槽为灰色有一定差异, 鱼类存在一定应激, 前2天不摄食, 第3天起开始摄食, 前4天内每条模拟水槽死亡3—5尾, 之后整个养殖实验周期无死亡现象。为了保持每条模拟水槽养殖密度同实际IPRA养殖密度(90尾/m3)保持一致, 在适应阶段的第7天每条水槽随机捞出1—3尾, 使得每条模拟水槽大口黑鲈养殖数量均为16尾/条, 养殖试验从7d适应阶段结束后即2020年5月30日开始, 10月30日结束, 养殖持续154d。每天投喂3次饲料(6:00、12:00和18:00), 达饱食水平, 并做好相关生产记录。
1.3 生长指标测定
在试验结束时, 4个水槽中各随机抽取10尾大口黑鲈, 现场测定其体重和体长, 并用消毒后的剪刀、镊子解剖取其内脏、肝脏和脂肪, 称量其重量, 计算大口黑鲈增重率(Weight Gain Rate, WGR, %)、特定生长率(Specific Growth Rate, SGR, %/d)、肝体指数(Hepatosomatic Index, HSI)、脏体指数(Viscerosomatic Index, VSI)和内脏脂肪指数(Visceral Adipose Index, VAI), 同时根据体长和体重计算肥满度(Condition Factor, CF, g/cm3), 并根据记录的饲料投喂量和每条水槽累计出鱼量, 计算饵料系数(Feed Coefficient, FC)和单位水体产鱼量(Fish Yield, FY, kg/m3)计算公式如下:
$ {\rm{WGR}} = \frac{({W}_{t} - {W}_{0})}{{W}_{0}} \times 100 \qquad\quad$
$ {\rm{SGR}} = \frac{\mathrm{L}\mathrm{n}\left({W}_{t}\right) - \mathrm{L}\mathrm{n}\left({W}_{0}\right)}{t} \times 100 $
$ \text{}\text{HSI}=\frac{{W}_{\mathrm{肝}\mathrm{脏}}}{{W}_{t}}\times 100\qquad\qquad\;\;\; $
$ \text{}\text{VSI}=\frac{{W}_{\mathrm{内}\mathrm{脏}}}{{W}_{t}}\times 100\qquad\qquad\;\;\; $
$ \text{}\text{VAI}=\frac{{W}_{\mathrm{脂}\mathrm{肪}}}{{W}_{t}}\times 100 \qquad\qquad\;\;\;$
$ {\rm{CF}}=\frac{{W}_{\mathrm{脂}\mathrm{肪}}}{{W}_{t}}\times 100\qquad\qquad\;\;\; $
$ {\rm{FC}}=\frac{{W}_{\mathrm{饲}\mathrm{料}}}{{W}_{\mathrm{鱼}}} \qquad\qquad\qquad\;\;\;$
$ {\rm{FY}}=\frac{{W}_{\mathrm{水}\mathrm{体}}}{{V}_{\mathrm{水}\mathrm{体}}}\qquad\qquad\qquad\;\;\; $
式中, Wt表示养殖t时间时的体重; W0表示试验开始时体重; L表示体长; W肝脏表示肝脏的重量; W内脏表示内脏组织的重量; W脂肪表示内脏脂肪组织重量; W饲料表示单位产鱼量投喂饲料量; W鱼表示单位产鱼量; W水体表示单位水体产鱼量; V水体表示单位水体。
1.4 血清生化指标测定
在测定生长指标之前, 随机采集各个水槽大口黑鲈各5尾, 尾柄抽血5 mL, 迅速注入10 mL的肝素钠抗凝管中, 于4℃保存, 12h内测定各血清指标, 然后每个水槽中的血清样品指标取平均值作为特定流速的1个重复。血清总蛋白(TP)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆汁酸(TBA)、总胆固醇(TC)和血糖(GLU)采用AURORA/Veras 10自动化工作站和SMT 100V生化自动分析工作站检测。甘油三酯(TG)、游离脂肪酸(EFA)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)和总抗氧化力(T-AOC)均采用南京建成生物工程研究所的试剂盒, 具体测定方法按照试剂盒的说明进行。
1.5 组织酶活指标测定
待抽完血后, 立即用75%酒精擦拭鱼体表后用蒸馏水漂洗, 消毒后的剪刀镊子解剖获取背部肌肉和肝脏, 置于冰面上的玻璃培养皿中, 迅速清除肝脏附着的脂肪, 并用PBS缓冲液反复冲洗肌肉和肝脏, 取约1 g肝脏和肌肉同一位置的组织分别放入2 mL的无菌离心管中, 立即放入液氮罐中速冻, 带回实验室后将肌肉和肝脏样品放入–80℃冰箱保存, 用于抗氧化酶、消化酶和脂肪代谢相关酶指标的测定。
需要检测的抗氧化指标包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)和总抗氧化力(T-AOC), 消化酶包括脂肪酶(LPS)、淀粉酶(AMS)和蛋白酶(PTS), 能量代谢相关酶包括谷氨酸脱氢酶(GDH)、激素敏感脂肪酶(HSL)和丙酮酸激酶(PK), 9种指标的测定均采用南京建成生物工程研究所的试剂盒, 具体测定方法按照试剂盒的说明进行。蛋白浓度用考马斯亮蓝染色法测定, 采用酶标仪测定吸光度值。每个水槽中的酶活指标取平均值作为特定流速的1个重复。
1.6 肌肉和肝脏营养成分分析
在测定生长指标之后, 各组随机取5尾大口黑鲈, 首先解剖获取肝脏, 再剖离背部肌肉, 剔除附着杂物后及时称重, 记录数据。暂存于–80℃冰箱中用于测定常规营养成分组成及含量。水分采用直接干燥法测定, 参考GB 5009.3-2010; 粗蛋白采用凯式定氮法测定, 参考GB 5009.5-2010; 粗脂肪采用索氏抽提法测定, 参考GB/T 5009.6-2003; 灰分采用马弗炉灼烧法测定, 参考GB 5009.4-2010。每个水槽中的营养成分取平均值作为特定流速的一个重复。
1.7 组织切片、扫描电镜和透射电镜制样
组织固定: 在测定生长指标时, 各组随机抽取3条大口黑鲈, 用75%酒精擦拭鱼体表后用蒸馏水漂洗, 消毒后的剪刀镊子获取背部统一位置直径0.5—0.8 cm的肌肉, 放入肌肉专用固定液中; 然后解剖获取肝脏, 取肝部同一位置直径0.5—0.8 cm的组织3份, 1份放入Bouin液中, 2份放入戊二醛电镜固定液中。
组织切片制样: 肌肉固定液和Bouin液中的肌肉和肝组织固定24h后, 用乙醇逐级脱水, 石蜡包埋后切片, 苏木素-伊红(HE, hematoxylin-eosin)染色, 用Motic BA210光学显微镜观察并拍照。
扫描电镜制样: 电镜固定液的肝脏经PBS缓冲液洗涤2次, 用4%(W/V)的蔗糖溶液洗涤1次, 用系列梯度酒精脱水, 加入100%酒精重悬后, 吸取少量悬液滴加在玻片上, 将玻片粘在导电胶上, 临界点干燥, 真空喷镀, 在SU8010(Hitachi公司)型扫描电镜下观察与摄片。
1.8 数据处理与统计分析
利用数据处理软件Excel 2010进行数据处理, 采用SPSS 20.0软件对文中所得数据进行单因素方差分析(One-way ANOVA), 显著性水平设为P<0.05; 实验结果以平均值±标准差表示。
2. 结果
2.1 不同流速下大口黑鲈生长性能和形体指标差异
由表 1可知, 中流速组大口黑鲈的增重率和特定生长率显著高于其他3个处理组(P<0.05), 高流速组的特定生长率显著低于其他3个处理组; 中、高流速肥满度显著低于静水组和低流速组(P<0.05); 肝体指数和脏体指数处理组之间无显著性差异(P>0.05); 大口黑鲈内脏脂肪指数高低顺依次为静水组>低流速组>中流速组>高流速组, 且之间存在显著性差异(P<0.05)。
表 1 不同处理组大口黑鲈生长性能和形体指标的差异Table 1. Difference of growth indices of M. salmoides (n=10)项目Item 静水组C 低流速组L 中流速组M 高流速组H 初重 Initial weight (g) 8.82±0.82 8.85±0.79 8.80±0.81 8.82±0.84 末重Final weight (g) 210.1±10.6 214.0±10.2 225.9±9.8 203.8±8.7 饵料系数FC 0.94±0.02 0.98±0.03 1.02±0.02 1.09±0.04 单位水体产鱼量FY (kg/m3) 18.67±1.22 19.02±1.31 20.08±1.32 18.04±1.25 增重率WGR (%) 2382.2±107.8a 2418.5±106.2a 2567.4±112.8b 2311.4±116.1a 特定生长率SGR (%) 1.89±0.035b 1.78±0.032b 2.14±0.035c 1.59±0.029a 肥满度CF (g/cm3) 2.12±0.02b 2.05±0.02b 1.89±0.02a 1.82±0.02a 肝体指数HSI 1.01±0.06 0.96±0.07 0.97±0.07 0.96±0.05 脏体指数VSI 6.89±0.57 6.79±0.56 6.95±0.65 6.84±0.63 内脏脂肪指数VAI 1.25±0.11a 0.89±0.08b 0.58±0.06c 0.33±0.05d 注: 同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05); 下同Note: In the same row, values with different small letter superscripts are significantly different (P<0.05). The same applies below 2.2 不同流速下大口黑鲈肌肉和肝脏常规营养成分指标差异
由表 2可知, 不同处理组肌肉和肝脏常规营养成分存在较大差异。对于肌肉而言, 中流速组粗蛋白显著高于其他3个处理组(P<0.05), 静水组和低流速组粗脂肪含量显著高于中、高流速组(P<0.05)。对于肝脏而言, 中、高流速组粗蛋白显著高于静水组和低流速组(P<0.05); 粗脂肪含量高低顺依次为静水组>低流速组>中流速组>高流速组, 且之间存在显著性差异(P<0.05); 高流速组粗灰分含量显著高于静水组。
表 2 不同处理组大口黑鲈肌肉和肝脏常规营养成分比较Table 2. Difference of routine nutritional components in muscle of M. salmoides (n=5; %)组织Tissue 项目Item 静水组C 低流速组L 中流速组M 高流速组H 肌肉 Muscle 粗蛋白 Crude protein 18.7±1.54a 18.5±1.35a 20.7±1.54b 18.5±1.58a 粗脂肪 Crude fat 6.72±0.61c 6.14±0.52c 4.58±0.44b 3.27±0.42a 粗灰分 Ash 1.39±0.08a 1.33±0.10a 1.35±0.11a 1.87±0.18b 水分 Moisture 77.6±5.5 76.5±5.9 73.5±4.9 74.2±4.1 肝脏 Liver 粗蛋白 Crude protein 23.24±1.84a 24.58±2.18a 26.14±2.71b 27.79±2.32b 粗脂肪 Crude fat 11.28±1.21d 9.54±1.05c 7.37±0.89b 5.19±0.47a 粗灰分 Ash 1.14±0.23a 1.29±0.15ab 1.25±0.16ab 1.45±0.14b 水分 Moisture 62.54±5.89 64.32±5.89 64.52±5.71 65.33±5.27 2.3 不同流速下大口黑鲈血清和肝脏生化指标的差异
运动对大口黑鲈血清生化和抗氧化指标产生较大影响(表 3), 血清中甘油三酯和总胆固醇变化趋势一致, 即中、高流速组显著低于静水组和低流速组(P<0.05); 高流速组游离脂肪酸显著低于其他3个处理组(P<0.05), 而总胆汁酸显著高于其他3个处理组(P<0.05); 高流速组总蛋白显著低于其他3个处理组(P<0.05), 而中流速组显著高于静水组和低流速组(P<0.05); 静水组血糖含量显著高于其他3个处理组(P<0.05)。中、高流速组谷草转氨酶显著高于静水组和低流速组(P<0.05), 且高流速组显著高于中流速组(P<0.05); 高流速组的碱性磷酸酶显著高于其他3组(P<0.05)。
表 3 不同处理组大口黑鲈血清和肝脏生化指标比较Table 3. Difference of biochemical and antioxidant indexes in serum of M. salmoides (n=5)项目
Item生化指标
Biochemical index静水组C 低流速组L 中流速组M 高流速组H 血清生化指标
Serum biochemical index甘油三酯TG (mg/mL) 2.35±0.18b 2.21±0.17b 2.05±0.15a 1.93±0.20a 游离脂肪酸EFA (μmol/L) 1.25±0.11b 1.12±0.10b 1.08±0.09b 0.87±0.08a 总胆固醇TC (mmol/L) 8.75±0.79b 8.19±0.76b 7.57±0.72a 7.18±0.75a 总胆汁酸TBA (μmol/L) 14.21±1.21a 14.82±1.32a 14.65±1.21a 17.84±1.41b 总蛋白TP (g/L) 35.6±2.41b 34.6±2.50b 38.7±2.50c 27.98±2.22a 血糖GLU (mmol/L) 6.28±0.54b 5.21±0.51a 5.44±0.48a 4.87±0.45a 谷草转氨酶AST (U/L) 192±11.9a 207±12.8a 218±11.80b 245.73±12.7c 碱性磷酸酶ALP (U/L) 62.21±3.31a 65.12±4.12a 65.01±3.80a 72.00±4.5.b 血清抗氧化指标
Serum antioxidant index超氧化物歧化酶SOD (U/mL) 52.32±4.12a 58.89±4.89b 69.87±6.02b 67.88±5.74b 过氧化氢酶CAT (U/mL) 4.21±0.52a 5.04±0.41b 5.15±0.48b 5.77±0.67c 丙二醛MDA (mmol/L) 18.87±1.51c 16.78±1.48b 13.25±1.12a 15.74±1.25b 总抗氧化力T-AOC (U/L) 178.21±12.91a 188.97±13.8a 223.14±18.40b 189.95±14.87a 肝脏抗氧化指标
Liver antioxidant index超氧化物歧化酶SOD (U/mg prot) 163.11±5.90 168.92±6.61 173.31±6.92 159.89±6.51 过氧化氢酶CAT (U/mg prot) 14.88±1.21a 15.81±1.44a 18.73±1.52b 17.65±1.51b 丙二醛MDA (U/mg prot) 1.72±0.33c 1.43±0.41bc 1.11±0.25a 1.53±0.31b 总抗氧化力T-AOC (U/mg prot) 1.64±0.27a 1.75±0.35ac 2.12±0.33b 1.89±0.32c 在血清抗氧化指标中, 静水组SOD和CAT显著低于其他3个处理组(P<0.05), 且随着水流速度的增加而升高; 静水组MDA含量显著高于其他3个处理组(P<0.05), 而中流速组最低, 显著低于其他3个处理组(P<0.05); 中流速组T-AOC最高, 显著高于其他3个处理组(P<0.05)。
在肝脏抗氧化指标中, 中、高流速组CAT活性显著高于静水组和低流速组(P>0.05); MDA含量顺序依次为中流速组<低流速组<高流速组<静水组, 且中流速组显著低于其他3个处理组(P<0.05); T-AOC顺序依次为中流速组>高流速组>低流速组>静水组, 且中流速组显著高于其他3个处理组(P<0.05)。
2.4 不同流速下大口黑鲈肠胃消化酶指标的差异
由表 4可知, 大口黑鲈不同组织消化酶活力变异较大, 肝脏和肠道是分泌脂肪酶的主要部位, 胃部是淀粉酶和蛋白酶的主要分泌部位, 其次是肠道, 最后是肝脏。不同处理组之间差异也较大, 肠道脂肪酶活性随着水流速度增强而增加, 中、高流速组显著高于静水组和低流速组(P<0.05); 流速组肠道蛋白酶显著高于对照组(P<0.05), 且中流速组显著高于低流速组和高流速组(P<0.05)。
表 4 不同处理组下大口黑鲈消化酶活力比较Table 4. Difference of digestive enzyme of M. salmoides (n=5; U/mg prot)组织Tissue 项目Item 静水组C 低流速组L 中流速组M 高流速组H 肠Intestine 脂肪酶 LPS 79.82±6.75a 86.82±9.10a 95.26±8.79b 105.61±9.78c 淀粉酶 AMS 93.53±8.81 96.81±8.25 99.54±9.54 97.26±8.91 蛋白酶 PTS 83.62±7.63a 96.56±8.72b 114.63±9.78c 101.22±9.24b 胃Stomach 脂肪酶LPS 31.25±3.45a 35.57±3.97a 42.61±4.15b 67.87±6.24c 淀粉酶AMS 152.82±14.21a 157.4±15.67a 181.82±18.98c 168.91±15.42b 蛋白酶PTS 112.35±11.24a 116.23±10.14a 128.47±11.44b 118.60±10.81a 肝Liver 脂肪酶LPS 90.61±8.47a 92.34±8.89a 99.89±8.98b 96.83±8.97ab 淀粉酶AMS 68.74±6.21a 85.15±8.12b 96.52±9.12c 108.79±9.59d 蛋白酶PTS 48.85±5.14a 52.61±5.60ab 58.74±5.47b 56.25±6.57b 胃组织中、高流速组脂肪酶和淀粉酶活性显著高于静水组和低流速组(P<0.05), 且高流速脂肪酶活性显著高于中流速组(P<0.05), 而中流速组淀粉酶活性显著高于高流速组(P<0.05); 中流速组蛋白酶活性最高, 显著高于其他3个处理组(P<0.05)。
对于肝脏组织而言, 中流速组脂肪酶活性最高, 显著高于静水组和低流速组(P<0.05); 淀粉活性顺序依次为高流速组>中流速组>低流速组>静水组, 处理组之间存在显著性差异(P<0.05); 中、高流速组蛋白酶活性显著高于静水组(P<0.05)。
如表 5所示, 肌肉和肝脏中谷氨酸脱氢酶均是随着流速的增加而显著升高(P<0.05); 中流速组肌肉和肝脏中激素敏感脂肪酶最高, 且肌肉激素敏感脂肪酶显著高于其他3个处理组(P<0.05); 中流速组肌肉和肝脏中丙酮酸激酶均显著高于其他3个处理组(P<0.05)。
表 5 不同处理组下大口黑鲈能量代谢酶活性比较Table 5. Difference of energy metabolizing enzyme of M. salmoides (n=5; U/mg prot)组织Tissue 项目Item 静水组C 低流速组L 中流速组M 高流速组H 肌肉 Muscle 谷氨酸脱氢酶GDH 1.32±0.22a 1.79±0.28b 2.17±0.18c 2.52±0.23d 激素敏感脂肪酶HSL 0.45±0.03a 0.62±0.05b 0.75±0.06c 0.65±0.05b 丙酮酸激酶PK 26.54±1.21a 35.87±2.32b 54.21±3.87c 43.5±3.21d 肝Liver 谷氨酸脱氢酶GDH 2.25±0.31a 2.99±0.33b 3.22±0.42c 3.45±0.31d 激素敏感脂肪酶HSL 1.25±0.21a 1.41±0.19ab 1.58±0.25bc 1.49±0.26b 丙酮酸激酶PK 11.25±1.21a 15.26±1.58b 23.58±1.87c 18.21±2.19b 2.5 不同流速下大口黑鲈组织结构形态差异
如图 2所示, 肌纤维直径顺序依次为低流速组>中流速组>静水组>高流速组, 且低流速组显著高于其他3个处理组(P<0.05), 静水组和中流速组均显著高于高流速组(P<0.05)。肌纤维密度随着水流速度增加而显著增加(P<0.05; 表 6)。
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图 2 不同水流速度对大口黑鲈肌肉显微结构(HE)的影响D. 肌纤维直径 fiber diameterFigure 2. Effects of different water velocity on the muscle microstructure (HE) of M. salmoides表 6 不同水流速度对大口黑鲈肌纤维直径和密度的影响Table 6. The effect of different water velocity on the diameter and density of muscle fiber from M. salmoides (n=5)指标Index 静水组C 低流速组L 中流速组M 高流速组H 肌纤维直径Fiber diameter (μm) 112.36±16.54b 132.14±14.56c 113.58±12.39b 98.84±8.75a 肌纤维密度Fiber density (根/单位面积) 34.61±2.63a 49.51±4.22b 66.89±5.98c 75.98±6.47d 如图 3所示, 不同水流速度均明显影响大口黑鲈肝组织结构。对照组细胞空泡化程度明显高于处理组。随着水流速度增加, 空泡化现象越来越低, 至高流速组出现了部分肝细胞边缘模糊, 细胞排列不整齐、细胞核偏移现象, 甚至组织结构的网状支架被破坏, 一些细胞核聚集在一起。与静水组和高流速组相比, 低、中流速组具有细胞形态正常, 肝血窦、细胞核等结构清晰, 无细胞核空泡化和细胞核偏移聚集等现象。
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图 3 不同水流速度对大口黑鲈肝脏显微结构(HE)的影响A. 肝细胞hepatocyte; B. 细胞核nucleus; C. 肝血窦hepatic sinusoid; D. 细胞空泡化cell vacuolation; E. 细胞核偏移nuclear migrationFigure 3. Effects of different water velocity on the liver microstructure (HE) of M. salmoides3. 讨论
3.1 流速对大口黑鲈生长性能和形体指标的影响
水流, 是鱼类生活环境中的重要生态因子, 一定的水流条件会促进鱼类游泳运动, 增强活动代谢, 改善其生理功能, 影响鱼类的摄食、生长和鱼体营养组成[9]。Young等[10]研究发现与没有运动训练的相比, 条纹鲈(Morone saxatilis)在经过1.2—2.4 bl/s流速的逆流运动训练后, 其增重率和特定生长率都有所增加, 而超过2.4 bl/s, 则增重率和特定生长率会降低; 斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)在1.0 bl/s流速下运动训练8周后, 增重率显著提高, 而在2.0 bl/s流速下增重率则显著下降[11]。这与本研究结果一致, 即中流速组大口黑鲈的增重率和特定生长率显著高于其他3个处理组, 说明在适宜的流速下鱼类的生长率达到最高, 低流速时鱼类的自发活动就会增多, 高流速时鱼类的游泳状态会不稳定, 导致鱼体疲劳而影响生长, 而持续性的适宜流水刺激一定程度上能够削弱鱼类种群中的攻击行为, 减少自主运动而产生的能量消耗, 有利于鱼体生长[12]。
相关研究表明运动对鱼体形态的影响主要与脂肪沉积有关, 适宜范围内的水流速度可以促进脂肪沉积, 导致肥满度、内脏脂肪指数上升[9], 但超过一定范围的运动, 鱼体会因脂肪分解供能而造成肥满度等指标出现下降[13, 14]。宋波澜等[15]在对多鳞四须鲃(Barbodes schwanenfeldi)的实验中发现, 设置3种流速(0、0.7和2.0 bl/s)条件下, 随流速增大, 鱼体粗脂肪含量显著下降; 而Li等[16]研究发现, 两种流速(1.0和1.5 bl/s)的运动锻炼有利于鱼体内脂肪的沉积, 其肥满度、脏体指数和肝体指数出现一定程度的上升。本研究中大口黑鲈内脏脂肪指数随着流速的增加而显著下降, 中、高流速组肥满度显著低于静水组和低流速组, 与上述研究存在一定差异。这可能是因为养殖品种与养殖环境之间的差异引起, 同时也说明在持续的游泳运动状态下, 大口黑鲈通过分解脂肪供能, 从而有效抑制内脏脂肪的沉积, 这一现象也与Yuan等[6]报道的IPRA养殖系统中大口黑鲈肥满度显著低于传统池塘养殖组的结果较一致。因此, 通过适宜水流刺激来促进鱼体运动, 可以提高鱼体代谢速率, 从而减少脂肪在鱼体内的过量累积, 提高对营养物质的吸收利用效率, 进一步提升商品鱼品质。
3.2 流速对大口黑鲈肌肉和肝脏常规营养成分的影响
水流运动会导致鱼体能量和物质代谢发生变化, 从而导致脂肪含量、营养成分发生变化, 同时对蛋白质、糖分等也产生影响[17]。目前, 国内外已有较多关于水流运动对鱼类营养成分的影响研究, 但结论不一。Yogata等[14]和Shin等[18]在研究流速对牙鲆(Paralichthysolivaceus)和虹鳟(Oncorhynchus mykiss)影响时发现水流运动未对两种鱼类的常规营养成分产生显著性差异; 而宋波澜等[15]和朱志明[17]发现适宜运动能促进多鳞四须鲃肌肉和肝脏蛋白质沉积但抑制了脂肪沉积。本研究结果表明中流速组肌肉粗蛋白显著高于其他处理组, 静水组和低流速组粗脂肪含量显著高于中、高流速组, 而高流速组肝脏粗蛋白显著高于静水组和低流速组, 粗脂肪含量随着流速的增加而显著降低, 说明不同流速对肌肉和肝脏产生了不同的影响, 中流速的大口黑鲈具有高蛋白低脂肪的特点, 较其他3个处理组肌肉品质有所改善。这主要是由于大口黑鲈随着运动量增加, 其代谢速率提高, 能量消耗加大, 首先大量消耗肝脏中的脂肪, 再分解蓄存在肌肉中的脂肪以供能, 因而造成肌肉和肝脏中脂肪随着运动量增加而降低; 同时肌肉蛋白质含量增加主要可能是由于持续性的运动锻炼促进了蛋白质的合成和转化效率[6]。大量研究也已证实适当运动会提高鱼体对糖类和脂肪的利用率[19], 从而减少蛋白质消耗, 有利于肌肉蛋白质的积累, 如逆流运动能明显提高吉富罗非鱼的蛋白质含量[20], 运动同样可提高黄尾鰤(Seriola lalandi)蛋白质含量[14], 但是当运动量过大时, 即当肌肉中的糖原和脂肪被消耗殆尽时, 则会进一步分解蛋白质以供能, 从而导致蛋白分解大于合成, 蛋白质含量有所降低[15]。
3.3 流速对大口黑鲈血清和肝脏生化指标的影响
鱼类在持续有氧运动时, 鱼类代谢和心率加快, 血液循环加速, 血清生化指标能比较直观反映鱼类运动时的生理状况[16]。在本试验中, 血清中甘油三酯、总胆固醇、游离脂肪酸、血糖和总蛋白随着流速的增加而下降, 说明在本试验条件下, 运动对蛋白质、脂肪和糖类三大营养物质代谢有着明显的影响, 尤其是在高流速高强度运动状态下, 这些指标显著性降低, 机体通过分解血脂和血糖甚至血蛋白进行供能。这一结果与Li等[21]研究结果不一致, 该研究发现运动训练(0.36 m/s, 4周)会导致鲤(Cyprinus carpio)血清中甘油三酯和总胆固醇显著上升, 这可能是由不同的鱼类品种、饲料营养差异、不同的运动强度及时间等因素造成, 具体作用机理有待进一步探索。本试验结果显示血清中总胆汁酸、谷草转氨酶和碱性磷酸酶则随着流速的增加而升高, 且至高流速组达到显著性水平, 综合肝体比、肝脏脂肪含量、血清甘油三酯、胆固醇、脂肪酸及肝脏组织结构等结果, 表明适当的运动强度会降低肝脏脂肪含量, 而高强度的运动则会引起肝脏组织细胞产生损伤, 从而造成血清相关指标发生显著性变化。这一结果与Azuma等[22]研究结果较一致。
运动调节免疫功能的主要是通过改变机体心血功能和代谢途径, 进而增加抵抗力, 因此运动训练也会对鱼类的免疫功能产生影响[18]。目前, 关于水流诱导的鱼类运动对鱼类免疫能力影响的研究还不多。Azuma等[22]发现大麻哈鱼(Oncorhynchus keta)在11周水流速度分别为2、13和22 cm/s运动训练后, 显著提高了血清SOD活性; 宋波澜[23]发现红鳍银鲫(Barbodes schwanenfeldi)在低流速(0.1 m/s)和高流速(0.3 m/s)的水流训练下其SOD、T-AOC随着水流速度的增加而升高; 而于丽娟[24]发现中华倒刺鲃(Spinibarbus sinensis)幼鱼免疫酶活性随着水流速度增加而升高, 当流速达到2 bl/s免疫酶活性达到最高, 其后随着流速的增加而又开始下降。本试验结果显示, 中流速组的血清和肝脏T-AOC均最高, 且肝脏中SOD、CAT活性最高, 而MDA含量最低, 说明适宜强度的水流运动可以增强抗应激能力, 改善鱼体机体状况, 提高抗氧化能力, 防止感染疾病, 而过量的运动会降低机体的抗氧化能力。
3.4 流速对大口黑鲈消化酶和代谢酶指标的影响
水流作为重要的影响因子可以刺激鱼类运动, 增强能量代谢, 从而使消化组织器官产生相应的反应机制[25]。目前对消化能力和生长的关系国内外已进行了大量深入的研究报道[26], 而关于水流对鱼类消化酶影响的研究仍较少。肝脏是消化酶合成的重要场所, 肠和胃是鱼类的主要消化场所, 分泌有大量消化酶, 消化酶活性的提高可以促进鱼类对各种营养物质的吸收利用。赵璐琪等[25]发现罗非鱼在水流运动训练7d和30d后的消化酶活性都显著高于对照组, 且随着流速的增加其消化酶活性也增大, 在2 bl/s组达到最大, 其后则开始降低; 许亚琴[27]发现4个水流速度(0、2、5和8 cm/s)显著影响拉氏鱥(Rhynchocypris lagowskii)幼鱼淀粉酶和脂肪酶活力, 呈现先升后降的趋势, 在5 cm/s流速组活力达到最高。本研究中肠胃脂肪酶活性随着流速增加而显著升高, 至高流速组达到最大, 中流速组胃的淀粉酶和蛋白酶活性则最高; 而对于肝脏, 则是中流速组脂肪酶和蛋白酶活性最高, 高流速组淀粉酶活性最高, 这与以往的报道存在一定差异, 这主要可能是因为不同品种的鱼类及训练环境等因素造成的[16]。
运动代谢是指鱼类自发的或因由水流因子及其他外界环境因子的刺激而产生主动或被动运动所表现出来的能量消耗[17], 而其代谢快慢受相关限速酶控制, 其中谷氨酸脱氢酶(GDH)、激素敏感脂肪酶(HSL)和丙酮酸激酶(PK)分别是蛋白质、脂肪和糖原供能分解的关键酶, 在一定程度上可以反映能量代谢强度[28]。目前, 对GDH的研究较多集中在植物及哺乳动物上, 而对水产动物的研究相关报道较少[29]。在本试验中, 随着流速增加肌肉和肝脏中GDH活性显著增加, 说明肝脏中不断合成GDH, 并运送到肌肉组织中, 推测随着流速增加, 肌肉组织不断增强分解蛋白质能力以供能, 同时也反映出肝脏组织可能存在一定损伤[29]。同样运动训练后虹鳟肌肉中PK活性会显著增加, 对葡萄糖利用率提高了28倍[30]; Anttila等[30]发现运动训练能有效提高褐鳟(Salmo trutta)肝脏的HSL活性, 增强脂肪代谢能力; 魏小岚等[11]试验表明在1.0和1.5 bl/s运动训练下GDH等蛋白代谢酶活性显著低于对照组, 而在高流速组2.0 bl/s则蛋白代谢酶活性则显著增强, 蛋白质分解供能进一步增强。可见, 运动对鱼类糖类、脂肪和蛋白质代谢整体上具有显著影响, 但研究结果也存在一些差异。本试验结果显示, 运动能显著增加能量代谢相关酶活, 且高流速组肌肉和肝脏中蛋白脂酶和HSL活性最高, 而PK则是中流速组最高, 其原因可能是大口黑鲈超过一定运动强度后, 肌肉和肝脏中储存的糖原被快速分解殆尽, 主要依靠脂肪和蛋白质供能。综上, 持续且适度的水流运动虽然能增强鱼体蛋白质消耗, 但是合成大于分解而使肌肉蛋白质累积, 同时适度消耗鱼体储存的脂肪和糖原, 改善机体生理代谢。
3.5 流速对大口黑鲈组织结构形态的影响
研究表明适宜的水流运动训练能有效改善肌肉的结构和形态, 增加鱼体肌纤维数目或直径[31], 促进其生长, 提高游泳能力[32]。如虹鳟在一定程度的游泳锻炼下肌纤维更加发达, 纤维数目和直径分别显著高于对照组[33], 欧鳟(Salvelinus confluentus)在3种水流速度(1.5、3.0和4.5 bl/s)运动训练4周后, 肌纤维直径比对照组分别提高40%、18%和20%, 数目分别提高14%、31%和15%[34], 这一现象也在溪红点鲑(Salvelinus fontinalus)的研究中发现[35]。而有报道显示金鱼在1.5 bl/s流速下, 肌纤维数目比对照组提高25%, 但在3.0和4.5 bl/s流速下则无显著性差异[36], 也有研究发现中华刺鲃经过1.0和2.0 bl/s的8周运动训练未对肌纤维直径和密度产生明显差异, 但在4.0 bl/s运动训练组显著降低了肌纤维直径, 显著增加了肌纤维密度[37]。综上可见有关运动对鱼肌纤维结构的影响并不一致, 主要受运动强度、运动时间及鱼类品种等因素的影响[35]。本试验结果显示低流速肌纤维直径最大, 其次为中流速、静水组和高流速组, 而纤维密度随着水流速度的升高而显著增加, 这与Harimana等[38]结果一致, 暗示适度的运动可以刺激肌纤维直径增大, 促进其增生, 提高生长率, 但是过高的水流刺激运动又会导致肌纤维直径缩小, 研究者认为由于这种较小的肌纤维更有利于游泳过程中氧气的扩散[36], 从而能够适应高强度运动下肌肉消耗氧气分解供能的需求。另外适度运动训练促进鱼类肌纤维直径和数目的增加是导致其生长率显著提高的主要原因[39, 40], 这与本试验中流速组最有最高的生长率结果一致。
肝脏是鱼类进行各种代谢途径的主要器官, 极易受到外界环境的影响, 对外部应激极其敏感[41]。当鱼类肝脏受到外界环境胁迫时, 其遭到损伤后的典型变化包括水肿变性、空泡化和肝细胞坏死等现象[42], 根据肝脏形态学的变化可以评估其所受的损伤程度。目前关于运动对鱼类肝脏组织形态的影响研究报道还不多。在本试验中, 与静水组和高流速组相比, 低、中流速具有细胞形态正常, 肝血窦和细胞核等结构清晰, 无细胞核空泡化和细胞核偏移聚集等现象, 说明静水组和高流速组均会导致肝脏组织受损, 而长期适度运动则有利于预防脂肪肝, 改善肝脏生理机能[43], 这与本试验中流速组具有最高的消化酶和免疫酶活性相一致。
4. 结论
本实验结果表明不同的运动强度会对大口黑鲈的生理生化状态产生不同的影响, 中流速组特定增重率和特定生长率最高, 而高流速组最慢; 中、高流速组具有条形好, 粗蛋白含量高的特点; 同静水组、低流速组相比, 中、高流速组可以增强机体消化能力和抗氧化能力, 且以中流速组改善效果最好; 同低、中流水组相比, 静水组和高流速组肝脏结构产生了轻微损伤。综上可知, 中流速组能够促进大口黑鲈生长, 提高机体抗氧化能力, 改善机体代谢, 增加粗蛋白含量, 抑制脂肪沉积, 有效改善肌肉营养品质。因此, 在本研究中, 从生理生化等指标及生产实际考虑, 0.4 m/s可以作为大口黑鲈IPRA养殖系统中最适养殖水流速度。
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图 1 翘嘴鲌Hba1和Hba2氨基酸序列与哺乳类、两栖类及其他硬骨鱼类比对分析
黑色阴影部分表示是相同的氨基酸残基。根据哺乳类的α球蛋白, 方框表示螺旋区域(A—H, 除了D)。功能残基的位置分别表示为α1β1结合残基(1)、α1β2结合残基(2)、亚铁血红素结合残基(h)和Bohr效应残基(b)。三角形表示氨基酸替换位点。上述氨基酸序列从GenBank/EMBL/UniprotKB中获得的登录号详见图 3
Figure 1. Alignment of C. alburnus amino Hba1 and Hba2 amino acid sequences with mammalia, amphibian and other teleosts
The black shade denotes the identical residues. According to mammalian α globins, the helical regions (A—H, except D) were outlined by boxes. The positions of functional residues are indicated by: α1β1 interfaces (1), α1β2 interfaces (2), heme binding (h), and Bohr effect residues (b). Triangles indicate changes at amino acids sites. Deduced amino acid sequences were obtained from GenBank/EMBL/UniprotKB, the accession numbers of which were dwelled on Fig. 3
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图 2 翘嘴鲌Hbb1和Hbb2氨基酸序列与哺乳类、爬行类、两栖类及其他硬骨鱼类比对分析
黑色阴影部分表示是相同的氨基酸残基。根据哺乳类的β球蛋白, 方框表示螺旋区域(A—H)。功能残基的位置分别表示为α1β1结合残基(1)、α1β2结合残基(2)和亚铁血红素结合残基(h)。三角形表示氨基酸替换位点。上述氨基酸序列从GenBank/EMBL/UniprotKB中获得的登录号详见图 4
Figure 2. Alignment of C. alburnus amino Hbb1 and Hbb2 acid sequences with mammalia, reptilia, amphibian and other teleosts
The black shade denotes the identical residues. According to mammalian β globins, the helical regions (A—H) were outlined by boxes. The positions of functional residues are indicated by: α1β1 interfaces (1), α1β2 interfaces (2), and heme binding (h). Triangles indicate changes at amino acids sites. Deduced amino acid sequences were obtained from GenBank/EMBL/UniprotKB, the accession numbers of which were dwelled on Fig. 4
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图 3 翘嘴鲌和其他脊椎动物Hba1和Hba2蛋白系统进化树(▲所示为翘嘴鲌)
Figure 3. The phylogenetic tree of Hba1 and Hba2 from C. alburnus (▲) and other vertebrate species
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图 4 翘嘴鲌和其他脊椎动物Hbb1和Hbb2蛋白系统进化树(▲所示为翘嘴鲌)
Figure 4. The phylogenetic tree of Hbb1 and Hbb2 from C. alburnus (▲) and other vertebrate species
表 1 Hba1、Hba2、Hbb1和Hbb2基因克隆所需引物序列
Table 1 The primers used for the cDNAs cloning of Hba1, Hba2, Hbb1 and Hbb2 genes
引物Primer 序列Sequence (5′—3′) Primers for partial fragment Hba1-F TCTGATAAGKACAMGGCTGTT Hba1-R ATGCCCAATGCAGGWTTAG Hba2-F GAACSACAGTGGWGAAGGGAG Hba2-R CTGACCTGGRCGAGGAACT Hbb1-F GGCAAGGGTGCTGATTSTA Hbb1-R CAGCCTGAAGTTGWCTGRATC Hbb2-F TGAGAAGAYCACCATCCAG Hbb2-R GTTAAGCAGTCAGCCWAAA Primers for 3′ RACE PCR 3′ GS-Hba1 01-F AGAATGCTGACCGTCTACCC 3′ GS-Hba1 11-F GGTCTGGTCCTGTGAAGAA 3′ GS-Hba2 01-F CATTGGGCAGACCTAAACC 3′ GS-Hba2 11-F ACGACAGTGGTGAAGGGAG 3′ GS-Hbb1 01-F TCCAGGGCAATCCCAAGGT 3′ GS-Hbb1 11-F ACTGTGCTAAATGCGTTGG 3′ GS-Hbb2 01-F CTCTACAACGCCGCTGCTA 3′ GS-Hbb2 11-F GGACAACATCAAAGCCACC 3′ RACE Outer TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT 3′ RACE Inner CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG Primers for 5′ RACE PCR 5′ GS-Hba1 01-F CCCACAAGGTCGTCTATTTT 5′ GS-Hba1 11-F AAAGCATGAAGTTCGCTCA 5′ GS-Hba2 01-F CTGACCTGGGCGAGGAACT 5′ GS-Hba2 11-F CTCCCTTCACCACTGTCGTTCCA 5′ GS-Hbb1 01-F TTCCAACGCATTTAGCACA 5′ GS-Hbb1 11-F GTTGTGCCACCTTGGGATT 5′ GS-Hbb2 01-F CATAGGTGGCTTTGATGTTG 5′ GS-Hbb2 11-F GATAGCAGCGGCGTTGTAG 5′ RACE Outer CATGGCTACATGCTGACAGCCTA 5′ RACE Inner CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG Note: Mixed bases: B-G/T/C; D-G/A/T; H-A/T/C; K-G/T; M-A/C; R-A/G; S-G/C; V-G/A/C; W-A/T; Y-C/T 
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表 2 翘嘴鲌Hba1、Hba2、Hbb1和Hbb2基因的cDNA全长序列信息
Table 2 The information for full-length cDNA sequences of Hba1, Hba2, Hbb1 and Hbb2 from C. alburnus
基因Gence 长度Length (bp) 5′UTR (bp) 3′UTR (bp) ORF (bp) 氨基酸的数目
Number of amino acidsHba1 652 108 115 429 143 Hba2 465 21 15 429 143 Hbb1 477 21 15 441 147 Hbb2 475 18 16 441 147
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表 3 翘嘴鲌Hba1、Hba2、Hbb1和Hbb2氨基酸序列与其他物种同源性(%)分析
Table 3 Identity analysis of C. alburnus Hba1, Hba2, Hbb1 and Hbb2 amino acid sequence with other species (%)
氨基酸Amino acid 斑马鱼Zebrafish 鲤Crap 非洲爪蟾Xenopus 大鼠Rat Hba1 93.0 68.5 44.8 51.0 Hba2 88.8 86.7 44.1 51.0 Hbb1 84.4 87.1 54.4 51.7 Hbb2 84.4 89.8 47.6 53.7 Note: GenBank/EMBL/UniprotKB databases accession numbers: Hba1 (Q90487, KTG39806.1, XP_018092516.1, NP_037228.1); Hba2 (NP_898889.2, KTF87195.1, NP_001081493.1, NP_001007723.1); Hbb1 (NP_001003431.1, XP_018973479.1, NP_001079742.1, NP_150237.1); Hbb2 (NP_001096600.1, XP_018929000.1, NP_001081497.1, NP_001106694.1). The order of accession numbers of each gene corresponds to zebrafish, crap, xenopus, and rat, respectively
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