LIGHT AND FEEDING TIME ON THE GROWTH, BIOLOGICAL CLOCK GENE EXPRESSION, AND LIPID METABOLISM GENE EXPRESSION IN HIPPOCAMPUS KUDA BLEEKER
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摘要:
文章以大海马(Hippocampus kuda)为研究对象, 分别设置2个光周期(L﹕D=16﹕8、L﹕D=12﹕12)和2个投饵时间策略(开灯后2h、关灯前2h), 分析大海马的生物钟系统之间及生物钟与脂类代谢之间的关系, 探究大海马人工养殖的适宜环境条件及其体内重要脂类物质的合成代谢条件。结果表明: 在所有组别中, 检测的7个钟基因中有6个基因(Clock、Bmal1、Per1、Per2、Per3和Cry1)在大海马的脑和肝脏中都有明显的节律性表达, 说明生物钟基因表达与光有较密切的关系。其中, 大海马在长光亮期(16﹕8)及开灯后2h投喂的条件下, 其脑中的中枢钟基因与肝脏中的外周钟基因间的协同性最佳, 表明该条件对大海马生长较为有利。此外, 大海马肝脏中8个脂类代谢相关基因(Hmgcr、Mvk、Mvd、Lss、Fdps、Cetp、Scap、Srebp1)在开灯后2h投喂的2个组别中都呈现了节律性表达, 而在关灯前2h投喂的2个组别中仅Hmgcr、Mvk、Scap、Srebp1等4个基因(L﹕D=16﹕8)和Hmgcr、Mvk、Scap、Mvd、Srebp1等5个基因(L﹕D=12﹕12)有明显节律性表达, 说明脂类代谢相关基因的表达与光影响并不非常密切, 大部分基因的表达受到了投喂时间的影响。总之, 实验证实了大海马中存在有完整的生物钟系统, 该生物钟系统与脂类代谢间存在紧密的联系。通过光和投喂时间的综合分析, 初步推断大海马养殖的适宜条件为长光亮周期及在有光时及时给饵(开灯后2h内), 该条件下能促使大海马的钟基因与代谢基因都呈现稳定的节律性表达, 且中枢钟系统与外周钟系统间的协同性达到最佳。同时, 也能较好地促进脂类物质的代谢合成和积累。
Abstract:Biological rhythms play a critical role in the metabolism of organisms. In this study, the juvenile Hippocampus kuda was used as the research object. Four treatments were established, including two photoperiods (L (light)﹕D (dark)=16﹕8, 12﹕12) and two feeding times (2h after light-on the and 2h before light-off), to analyze the interaction between the two biological clock systems of H. kuda and their relationship with nutrient metabolism. The aim was to determine the optimal environmental conditions for artificial breeding and the conditions necessary for the synthesis of important metabolites in H. kuda. Results showed that under long photoperiod (L﹕D=16﹕8) with feeding 2h after light-on, H. kuda exhibited the highest specific growth rate in body length (SGRL) and body weight (SGRW), as well as the highest condition factor (CF) in all four treatments. Rhythmic expressions were observed in six clock genes (Clock, Bmal1, Per1, Per2, Per3, and Cry1) and eight lipid-related metabolic genes (Hmgcr, Mvk, Mvd, Lss, Fdps, Cetp, Scap, and Srebp1). The trend of clock gene expression in the brain throughout the day, and its peak expression, was consistent with those in liver, which correlated with SGRL, SGRW, and CF. However, in the treatments where feeding occurred 2h before light-off, these parameters were significantly lower than those with feeding 2h after light-on. Additionally, the central clock system and the trend of clock gene expression in the brain throughout the day, including peak expression times, differed completely from those in the liver. Only four lipid-related metabolic genes (Hmgcr, Mvk, Scap, and Srebp1) exhibited rhythmic expression under the long photoperiod, while five lipid-related metabolic genes (Hmgcr, Mvk, Mvd, Scap, and Srebp1) exhibited rhythmic expressions under the short photoperiod. The study suggests that H. kuda possesses a comprehensive biological clock system closely linked to lipid metabolism. Combined analysis indicated that stable rhythmic expression of clock genes and metabolic genes could be maintained under the conditions of L:D=16:8 with feeding 2h after light-on. Under these conditions, the clock gene expression in the brain and liver tended to synchronize, promoting the growth of H. kuda and maintaining the normal lipid metabolism pathway. These findings provide a scientific basis for promoting lipid synthesis and accumulation in H. kuda.
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Keywords:
- Photoperiod /
- Feeding time /
- Biological clock genes /
- Culture conditions /
- Hippocampus kuda
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中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis), 又称河蟹、大闸蟹, 属甲壳纲(Crustacea)十足目(Decapoda)方蟹科(Grapsidae) 绒螯蟹属(Eriocheir), 是我国重要的淡水养殖甲壳类动物之一[1]。国内外对中华绒螯蟹的研究主要集中在遗传育种、病害防治、营养调控及风味品质等[2—14]方面。为了充分利用土地、水力和饵料资源, 提高养殖产量, 稻渔共养模式和稻蟹共养模式逐渐被大众认可[15, 16]。一方面, 稻田条件能够为养殖品种提供充足的水源、良好的光照和丰富的天然饵料。另一方面, 养殖品种排泄物还可以为水稻提供氮、磷等养分, 从而促进水稻生长。此外, 稻田中的天然植物和生物作为中华绒螯蟹天然饵料, 能有效减少环境污染, 同时还能带来额外的经济创收[17]。研究发现适宜的放养密度对养殖品种健康生长、绿色生态及经济增收均具有重要意义[18—23], 有学者发现在不同的养殖模式下中华绒螯蟹可食部位的营养组成存在差异[24]。鲫(Carassius auratus)为温水性鱼类, 喜在水的底层活动, 对低氧的适应能力很强, 是杂食性鱼类, 主要食有机碎屑、水草、植物种子及摇蚊幼虫、枝角类和桡足类。由于其对养殖环境条件要求较低, 抗病能力强, 可适应多种养殖模式, 并且混养适宜数量的鲫有利于提高主养品种的品质[25, 26]。本研究在传统的“坑沟式稻−蟹综合种养”模式的基础上, 混养了3种不同密度的鲫, 不需要额外投喂鲫饵料, 摄食中华绒螯蟹的残饵、代谢物及天然饵料等, 达到养殖环境生态平衡。通过探讨对中华绒螯蟹、鲫生长和营养成分的影响, 寻找一种节能且绿色可持续发展的健康养殖新模式。
1. 材料与方法
1.1 实验材料与管理
在辽宁省淡水水产科学研究院稻鱼蟹健康生态研发基地(盘锦)选取12块平均面积为0.65667 m2的相邻稻田, 在田块一侧开挖养殖边沟, 边沟面积为田块面积的10%, 边沟宽为3 m, 深1 m, 设置进、排水管并包上防逃网, 用中华绒螯蟹养殖专用的聚乙烯塑料薄膜把稻田四角围成半圆弧形, 以防止逃逸和敌害。5月底至6月初进行水稻插秧, 选择的水稻品种为盐粳927号, 株行距为26 cm×20 cm, 水深15—20 cm。在插秧结束1个月后, 投放相同密度中华绒螯蟹[(23.48±0.82) g/尾, 300只/667 m2, 雌雄各半], 3块对照实验田只投放中华绒螯蟹(T0组), 另外9块实验田按照100、200 和300 尾/667 m2三个密度投放鲫(T1、T2和T3组)。选用的是异育银鲫中科3号, 投放的规格(48.53±2.11) g/尾, 实验期90d。每天下午3点按中华绒螯蟹体重的3%—5%在固定点投喂蟹料, 固定点设置在靠近岸边的位置, 饲料粗蛋白含量在38%左右(表 1)。
表 1 日粮组成及营养水平 (风干基础)Table 1. Diet composition and nutritional levels (air-dried basis)原料Ingredient 含量Content (%) 鱼粉Fish meal 25.10 虾粉Shrimp powder 8.22 豆粕Soybean meal 30.50 菜粕Rapeseed meal 11.35 面粉Flour 15.53 麦麸Wheat bran 3.18 大豆油Soybean oil 2.12 磷酸二氢钙Ca(H2PO4)2 2.50 预混料Premix1 1.00 食盐Salt 0.50 营养水平Nutrient levels 能量Energy (MJ/kg) 18.25 粗蛋白质Crude protein 37.97 粗脂肪Crude fat 5.52 水分Moisture 9.24 粗灰分Ash 4.40 注: 1预混料可为每千克日粮提供: 铜20 mg; 铁25 mg; 镁12 mg; 锰26 mg; 锌80 mg; 硒0.16 mg; 碘0.45 mg; 钴0.6 mg; 维生素A 10000 IU; 维生素E 100 mg; 维生素C 100 mg; 维生素D 32500 IU; 维生素K 32.2 mg; 维生素B1 3.2 mg; 维生素B2 15 mg; 维生素B3 20 mg; 维生素B4 10 mg; 维生素B5 25 mg; 维生素B12 0.016 mg; 叶酸5 mg; 胆碱 600 mg; 生物素 0.15 mg; 肌醇 200 mgNote: 1premix provide the follow per kg of basal diet: Cu 20 mg; Fe 25 mg; Mg 12 mg; Mn 26 mg; Zn 80 mg; Se 0.16 mg; I 0.45 mg; Co 0.6 mg; vitamin A 10000 IU; vitamin E 100 mg; vitamin C 100 mg; vitamin D 32500 IU; vitamin K 32.2 mg; vitamin B1 3.2 mg; vitamin B2 15 mg; vitamin B3 20 mg; vitamin B4 10 mg; vitamin B5 25 mg; vitamin B12 0.016 mg; folic acid 5 mg; choline 600 mg; biotin 0.15 mg; inositol 200 mg 1.2 实验样品采集
在实验结束后对中华绒螯蟹和鲫进行捕捞, 称重查数, 测量壳长、壳宽、体长和全长, 随后将中华绒螯蟹体表水分擦净并活体解剖, 每组采集30只雌蟹和30只雄蟹的肝胰腺、性腺、体肌肉和腿(附肢)肌肉进行称重记录, 分装至自封袋, –18℃保存, 待测。
1.3 实验方法
实验水体指标的测定 使用哈西SL1000便携式多参数水质分析仪测定水体中水温(T)、溶解氧(DO)和pH。氨氮(Ammonia-nitrogen, NH4-N)含量采用纳氏试剂分光光度法测定; 亚硝酸盐氮(Nitrite-nitrogen, NO2-N)含量采用盐酸萘乙二胺分光光度法测定; 总氮(Total nitrogen, TN)的含量采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法测定; 总磷(Total phosphorus, TP)的含量采用钼锑抗分光光度计法测定; 化学需氧量(Chemical oxygen demand, COD )采用高锰酸钾法测定。
生长和可食性状指标:
存活率(SR, %)=Nt/N0×100
增重率(WGR, %)=(Wt–W0)/W0×100
特定生长率(SGR, %/d)=(lnWt–lnW0)/t×100
摄食率(FR, %/d)=FI/[t×(Wt+W0)/2]×100
饲料系数(FCR)=FI/(Wt–W0)
出肉率(MY, %)=肌肉重(g)/体重(g)×100
肝胰腺指数(HSI)=肝胰腺重(g)/体重(g)×100
性腺指数(GSI)=性腺重(g)/体重(g)×100
总可食率(TEY, %)=HSI+GSI+MY
式中, Wt为鱼、蟹终末体质量(g); W0为鱼、蟹初始体质量(g); t为饲喂天数(d); FI为实验期间总摄食量(g); Nt为终末个体数; N0为初个体数。
常规营养成分、氨基酸测定 水分采用恒温干燥法(GB 5009.3-2016)测定; 粗蛋白采用微量凯氏定氮法(GB 5009.5-2016)测定; 粗脂肪采用索氏抽提法(GB 5009.6-2016)测定; 灰分采用高温炉灼烧法(GB 5009.4-2016)测定; 氨基酸参照GB/T 5009.124-2016, 用液相色谱仪(Agilent 1260)测定。
营养评价方法 参考联合国粮食及农业组织/世界卫生组织的氨基酸评分模式和全鸡蛋蛋白质氨基酸模式[27], 按以下公式计算氨基酸评分(AAS)、化学评分(CS)、必需氨基酸指数(EAAI):
$$ {\mathrm{AAS}} = \frac{\mathrm{待}\mathrm{测}\mathrm{蛋}\mathrm{白}\mathrm{质}\mathrm{氨}\mathrm{基}\mathrm{酸}\mathrm{含}\mathrm{量}}{\mathrm{F}\mathrm{A}\mathrm{O}/\mathrm{W}\mathrm{H}\mathrm{A}\mathrm{评}\mathrm{分}\mathrm{模}\mathrm{式}\mathrm{氨}\mathrm{基}\mathrm{酸}\mathrm{含}\mathrm{量}}\;\;\;\;\;\;\; $$ $$ {\mathrm{CS}} = \frac{\mathrm{待}\mathrm{测}\mathrm{蛋}\mathrm{白}\mathrm{质}\mathrm{氨}\mathrm{基}\mathrm{酸}\mathrm{含}\mathrm{量}}{\mathrm{全}\mathrm{鸡}\mathrm{蛋}\mathrm{蛋}\mathrm{白}\mathrm{质}\mathrm{同}\mathrm{种}\mathrm{氨}\mathrm{基}\mathrm{酸}\mathrm{含}\mathrm{量}}\qquad\;\;\;\; $$ $$ {\mathrm{EAAI}} = \sqrt[\uproot{15}{{n }}]{\frac{100\mathrm{A}}{\mathrm{A}\mathrm{E}}\times \frac{100\mathrm{B}}{\mathrm{B}\mathrm{E}}\times \frac{100\mathrm{C}}{\mathrm{C}\mathrm{E}}\times \cdots \times \frac{100\mathrm{J}}{\mathrm{J}\mathrm{E}}} $$ $$ {{F}}值 = \frac{\mathrm{缬}\mathrm{氨}\mathrm{酸}+\mathrm{亮}\mathrm{氨}\mathrm{酸}+\mathrm{异}\mathrm{亮}\mathrm{氨}\mathrm{酸}}{\mathrm{苯}\mathrm{丙}\mathrm{氨}\mathrm{酸}+\mathrm{酪}\mathrm{氨}\mathrm{酸}} $$ 式中, n为比较的必需氨基酸(EAA)数目; A, B, C, ···, J为肌肉蛋白质的EAA含量(DM, %); AE, BE, CE, ···, JE为全鸡蛋蛋白质的EAA含量(DM, %)。
1.4 数据处理
结果采用Excel 2010进行统计, SPSS 20.0软件进行方差齐性检验和单因素方差分析(One-way ANOVA), 采用Duncan氏多重比较法分析组间差异显著性。P<0.05表示差异显著, 数据以平均值±标准差(mean±SD) 表示。
2. 结果
2.1 不同养殖密度以及混养比例对水质环境的影响
在实验期间各实验组亚硝酸盐氮、总磷、水温和pH各组差异不显著(P>0.05)。T2和T3组池塘溶解氧含量低于其他2组, 氨氮含量高于其他2组; T3组的化学需氧量和总氮含量显著高于其他3组(P<0.05; 图 1)。根据GB 3838-2002地表水环境质量标准, 均符合Ⅲ类以上渔业用水标准。从水质理化指标看出, 随着混养鲫密度的提高, 水质指标受到了一定的影响, 但是具有可控性。
2.2 中华绒螯蟹和鲫生长指标及中华绒螯蟹可食性状分析
由图 2可知, T1组中华绒螯蟹增重率、特定生长率和摄食率均显著高于其他各组, 饵料系数则显著低于其他各组(P<0.05), 随着混养密度的增加, 鲫特定生长率和增重率逐渐下降。T1组鲫终末体质量、特定生长率和增重率均显著高于T2、T3组(P<0.05); 而各实验组中华绒螯蟹和鲫的存活率差异不显著(P>0.05)。
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图 2 中华绒螯蟹和鲫生长指标比较Figure 2. Comparison of growth indices of E. sinensis and C. auratus中华绒螯蟹的MY、HSI、GSI和TEY见表 2。以MY指标为参照, T1的中华绒螯蟹出肉率最高, 显著高于其他组(P<0.05); 比较HSI指标发现, T1的雌性中华绒螯蟹肝胰腺指数最高, T2的雄性中华绒螯蟹肝胰腺指数最高, 显著高于T3和T0 (P<0.05); 比较GSI指标和TEY指标发现, 同样是T1最高, 显著高于其他组(P<0.05)。综合各组中华绒螯蟹和鲫的生长、可食性状等指标, 混养鲫密度为100 尾/667 m2的T1组最优, 其次为T2组。
表 2 各组中华绒螯蟹的可食性状比较Table 2. Comparison of edible tissues of E. sinensis from different groups (n=15; %)组别Group 出肉率MY 肝胰腺指数HSI 性腺指数GSI 总可食率TEY ♀ ♂ ♀ ♂ T0 10.09±0.75a 8.23±0.36a 6.14±0.17a 6.26±0.21b 1.71±0.03a 22.55±0.76a T1 18.23±1.03d 10.04±0.34c 8.13±0.22c 7.48±0.10c 2.43±0.14c 32.42±1.32c T2 13.20±1.12c 9.97±0.26c 9.08±0.15d 5.89±0.29ab 1.95±0.05b 26.20±0.99b T3 12.03±0.87b 9.19±0.37b 7.07±0.07b 5.24±0.23a 2.04±0.08b 22.91±1.21a 2.3 混养不同密度的鲫对中华绒螯蟹肌肉常规营养成分的影响
中华绒螯蟹肌肉的水分、粗蛋白、粗脂肪和灰分见表 3。粗蛋白含量随着混养鲫密度的增大呈先升高后降低的趋势, T2 组显著高于其他组, 3个实验组的粗脂肪含量显著高于T0组, T3组的灰分含量最高(P<0.05); 水分各组之间无显著差异(P>0.05)。
表 3 各实验组中华绒螯蟹肌肉常规营养成分(鲜质量基础 ％)Table 3. Nutrients composition in muscle of E. sinensis from different groups (fresh weight basis %)组别
Group水分
Moisture粗蛋白
Crude protein粗脂肪
Crude fat灰分
AshT0 77.35±1.22 17.61±0.44b 0.81±0.05a 2.56±0.03b T1 77.43±1.35 17.41±0.38b 0.95±0.09b 2.13±0.05a T2 76.94±0.87 18.23±0.51c 0.91±0.11b 2.12±0.10a T3 77.74±0.95 16.55±0.31a 0.89±0.06b 2.91±0.04c 2.4 混养不同密度的鲫对中华绒螯蟹肌肉氨基酸含量的影响
如表 4所示, 中华绒螯蟹肌肉中共检出17种氨基酸。总氨基酸(∑TAA)和必需氨基酸(∑EAA)含量都呈先升后降的趋势, 在T2组达到最大值, 其次是T1 (P<0.05); ∑EAA中苏氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸含量在T2组显著高于其他各组(P<0.05); 异亮氨酸含量在T1和T2组显著高于T0和T3组(P<0.05)。呈味氨基酸(∑FAA)和非必需氨基酸(∑NEAA)含量也呈先上升后下降的趋势, 且T2组相比其他组差异显著(P<0.05); ∑FAA中天冬氨酸、谷氨酸和丙氨酸, 以及∑NEAA 中丝氨酸含量在T2组达到最大值(P<0.05)。
表 4 中华绒螯蟹肌肉中氨基酸含量(湿重, n=3)Table 4. The amino acids content in muscle of E. sinensis (%wet weight, n=3)指标
Parameter组别Group T0 T1 T2 T3 苏氨酸Thr* 0.57±0.02a 0.63±0.03a 0.70±0.02b 0.59±0.05a 缬氨酸Val* 0.60±0.01 0.67±0.03 0.64±0.02 0.63±0.04 蛋氨酸Met* 0.17±0.02 0.18±0.02 0.23±0.03 0.22±0.00 异亮氨酸Ile* 0.39±0.05a 0.65±0.06bc 0.76±0.03c 0.58±0.09b 亮氨酸Leu* 0.98±0.07a 1.04±0.06a 1.21±0.13b 0.94±0.11a 苯丙氨酸Phe* 0.54±0.06a 0.59±0.05a 0.68±0.01b 0.54±0.04a 赖氨酸Lys* 1.01±0.11a 1.09±0.08a 1.27±0.05b 1.06±0.10a 组氨酸His+ 0.48±0.02 0.49±0.05 0.46±0.03 0.43±0.06 精氨酸Arg+ 1.22±0.36a 1.28±0.39a 1.46±0.31b 1.15±0.12a 天冬氨酸Asp#& 1.21±0.15a 1.33±0.22b 1.47±0.17c 1.16±0.08a 谷氨酸Glu#& 2.00±0.45ab 2.12±0.31b 2.48±0.48c 1.91±0.26a 甘氨酸Gly#& 0.84±0.11b 0.83±0.07b 0.77±0.14a 0.83±0.21b 丙氨酸Ala#& 1.19±0.22a 1.27±0.25a 1.46±0.23b 1.20±0.15a 脯氨酸Pro& 0.65±0.08 0.73±0.10 0.72±0.09 0.64±0.05 丝氨酸Ser& 0.52±0.06a 0.55±0.03a 0.6±0.07b 0.49±0.05a 半胱氨酸Cys& 0.09±0.00 0.08±0.01 0.09±0.05 0.08±0.03 酪氨酸Tyr& 0.43±0.04 0.455±0.07 0.52±0.05 0.42±0.08 总氨基酸TAA 12.88±1.85a 13.95±1.83b 15.68±1.91c 12.81±1.52a 必需氨基酸EAA 4.26±0.35a 4.84±0.35b 5.59±0.35c 4.56±0.44a 鲜味氨基酸FAA 5.24±0.95a 5.54±0.85a 6.19±1.02b 5.09±0.71a 非必需氨基酸NEAA 6.93±1.09a 7.35±1.04a 8.12±1.22b 6.72±0.90a EAA/TAA 0.33 0.35 0.36 0.36 EAA/NEAA 0.62 0.66 0.68 0.68 注: *必需氨基酸; +半必需氨基酸; #鲜味氨基酸; &非必需氨基酸Note: *essential amino acids (EAA); +half-essential amino acids (HEAA); #flavor amino acids (FAA); &non-essential amino acids (NEAA) 2.5 混养不同密度鲫的中华绒螯蟹肌肉营养品质评价
根据FAO/WHO理想模式, 中华绒螯蟹肌肉中EAA/TAA在34%—36%, 基本符合FAO/WHO理想模式中品质较好蛋白质的指标(表 5)。同时, 中华绒螯蟹肌肉中必需氨基酸组成较为均衡, 营养价值较高。其中赖氨酸最高(CS: 1.69—2.13; ASS: 1.37—1.65), 蛋氨酸+半胱氨酸评分最低(CS: 0.38—0.47; ASS: 0.67—0.83), 为限制性氨基酸, 其他氨基酸评分均在1.00左右或高于1.00。T0、T1、T2和T3组EAAI分别为85.62、96.86、109.99和92.86, T2组优于其他3组。
表 5 不同组别中华绒螯蟹肌肉中必需氨基酸评分Table 5. Essential amino acid score (EAAS) in muscle of E. sinensis from different groups必需氨基酸
Essential amino acidASS CS T0 T1 T2 T3 T0 T1 T2 T3 异亮氨酸Ile 0.89 1.48 1.74 1.33 0.67 1.10 1.30 0.99 亮氨酸Leu 1.26 1.33 1.56 1.21 1.04 1.10 1.29 1.00 赖氨酸Lys 1.69 1.82 2.13 1.69 1.37 1.41 1.65 1.37 苏氨酸Thr 1.30 1.43 1.59 1.34 1.12 1.23 1.37 1.16 缬氨酸Val 1.11 1.23 1.37 1.16 0.84 0.93 0.89 0.87 蛋氨酸+半胱氨酸
Met+Cys0.67 0.67 0.83 0.78 0.38 0.38 0.47 0.44 苯丙氨酸+酪氨酸
Phe+Tyr1.46 1.57 1.80 1.44 0.99 1.06 1.22 0.98 必需氨基酸指数
EAAI85.62 96.86 109.99 92.86 3. 讨论
3.1 混养不同密度鲫对水环境、生长、可食部分近似组成及常规营养成分的影响
养殖环境、养殖密度和配合饲料等都会影响养殖动物生长和营养成分[28]。有研究发现稻−鱼−蟹混合养殖在一定程度上能够减少水体中有效钾、全氮和COD含量, 有利于维护水质、保护生态、促进生长[29, 30]。本实验发现低密度混养鲫的实验组其水质指标和对照组差异不显著, 这是因为鲫属于底层杂食性鱼类, 在水体中游动时会搅动底部水体流动, 促使底部残饵粪便进入到溶解氧丰富的水体中并加快其氧化分解, 提高水体营养盐含量。营养盐含量丰富则有利于水体溶解氧和浮游生物含量的提高, 从而增加养殖对象的饵料来源[25]。另外, 由于稻田水深较浅, 底层水体受到的阳光照射强度更高, 能促使更多的微生物繁育, 可以提高养殖动物肠道微生物多样性和丰富度, 提高其对营养物质的吸收和代谢能力, 促进生长[31]。有学者在点篮子鱼(Siganus guttatus)和文蛤(Meretrix meretrix)混养实验中发现, 混养一定密度的鱼类能让文蛤肌肉营养品质更佳, 但随着混养密度的增高其生长和营养成分受到一定影响[32]。这和本研究结果相似, T1组中华绒螯蟹和鲫生长指标最好, 随着混养鲫密度的增加中华绒螯蟹和鲫生长指标均呈下降趋势, 分析原因是T1组放养的鲫密度较低, 能够充分利用残余的中华绒螯蟹饵料、排泄物及水质中天然饵料, 物种之间不存在竞争关系, 二者生长速度迅速。但随着放养鲫密度增大, 加剧了空间和摄食竞争, 鲫和中华绒螯蟹活动增加, 消耗能量变多, 生长指标随之降低。
肝胰腺、性腺和肌肉是中华绒螯蟹的重要可食用部位。本研究中随着混养鲫密度的增加, HSI指标和GSI指标均呈先升高后降低趋势, 以T1组最高, 可见肝胰腺发育和性腺发育呈正相关。肝胰腺是中华绒螯蟹重要的营养储存部位, 研究发现肝胰腺的营养物质积累对其性腺发育至关重要[33, 34]。此外, 我们发现在稻田养殖模式下实验组中华绒螯蟹的MY和TEY值都明显高于对照组, 但随着混养鲫密度的增加呈下降的趋势, 说明混养密度增加可能造成中华绒螯蟹营养不良并发育迟缓, 从而影响生长指标。
肌肉中的蛋白质和脂肪是中华绒螯蟹主要的营养物质[35], 为其新陈代谢输送更多能量, 保障其健康[36—38]。梁洁等[39]研究发现, 养殖环境能影响小龙虾(Procambarus clarkii)鲜肉中粗蛋白质含量, 适宜的养殖环境让肉质更加鲜嫩, 营养价值更高。本研究中发现T2组中华绒螯蟹粗蛋白含量最高, 同时3个实验组的粗脂肪含量都显著高于对照组, 由此可见混养一定密度的鲫, 能够提高中华绒螯蟹的营养价值。蛋白质含量较高, 说明其对饲料的蛋白利用率就相对较高, 从而可以节省成蟹养殖阶段的饲料成本, 减少水体污染[40]。
3.2 混养不同密度鲫对中华绒螯蟹肌肉中氨基酸组成的影响
氨基酸是甲壳类动物最重要的能量来源, 氨基酸组成是反映中华绒螯蟹营养价值的重要指标之一[41]。本研究发现, 中华绒螯蟹肌肉组织中鲜味氨基酸含量均较高, 尤其是谷氨酸、天冬氨酸和丙氨酸。而EAA/TAA比值0.34—0.36, 均在其最佳比例0.4左右, 这进一步证实稻田蟹具有味道鲜美、营养丰富等特点[31]。足量的必需氨基酸是维持机体生长和健康的基础, 是营养价值的体现[42], 也是中华绒螯蟹肝胰腺和性腺发育的关键营养物质[43]。
相比中华绒螯蟹肌肉中其他氨基酸含量, 本研究发现赖氨酸、精氨酸、谷氨酸含量(1.27%、1.46%、2.48%)最高, 这和徐志善等[44]研究结果一致, 高于早熟蟹(1.02%、1.34%、2.05%)、辽河入海水域的野生蟹(雌蟹: 1.05%、1.18%、1.84%; 雄蟹: 1.04%、1.05%、1.82%)及未混养鱼类的稻田蟹(1.19%、1.53%、2.39%)[24, 45, 46]。这3种氨基酸不仅能促进生长发育、增强机体免疫力、抗病毒、促进脂肪氧化等, 还可提高蛋白质代谢, 参与身体内氧化过程, 改善中枢神经系统功能。其中的谷氨酸是重要的鲜味氨基酸, 对香味具有增强作用[47]。
另外, 中华绒螯蟹可食部位营养成分的差异与养殖环境密切相关[48, 49]。在本研究中, 随着混养鲫密度的增加, ∑TAA和∑EAA含量均呈现先上升后下降趋势, 尤其是苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸含量。苏氨酸在机体内的代谢途径和其他氨基酸不同, 可以通过苏氨酸脱水酶(TDH)和苏氨酸脱酶(TDG)及醛缩酶催化而转变为甘氨酸等。异亮氨酸、亮氨酸属脂肪族中性氨基酸的一种, 为防止肌肉损失, 很容易转化为葡萄糖。苯丙氨酸属芳香族氨基酸, 在体内大部分经苯丙氨酸羟化酶催化作用氧化成酪氨酸, 并与酪氨酸一起合成重要的神经递质和激素, 参与机体糖代谢和脂肪代谢。赖氨酸更多蓄积在肌肉组织的细胞内, 和天冬氨酸密不可分, 因为天冬氨酸经过反应合成二氨基庚二酸(DAP), 进而合成赖氨酸, 还可以合成苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸[50]。总之, 他们在动物体内含量不稳定, 随着外界环境变化和机体代谢而进行转化与合成。在本实验中, 随着鲫密度增加产生了竞争关系, 影响中华绒螯蟹和鲫生长和代谢, 从而导致体内这几种氨基酸含量出现了明显变化。
4. 结论
在本实验条件下, 混养适量密度的鲫不仅可提高或改善中华绒螯蟹的生长性能、可食性状、肌肉粗蛋白和粗脂肪含量、必需氨基酸含量及评分, 而且对水环境指标影响较小, 且混养100—200 尾/667 m2鲫对中华绒螯蟹的上述促进效果最佳。利用稻田的浅水环境辅以人为措施, 将养殖与种植有机结合, 充分利用稻田中的一切生物和非生物资源的同时又增加了稻田养殖的经济、生态和社会效益, 是一项值得推广的无公害养殖模式。
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图 1 各组海马大脑中的钟基因的24h表达谱
余弦波的存在表明各基因的表达存在明显的生物节律性; X轴上黑白色条表示光周期的光暗期和光亮期; 不同字母表示各基因在各采样时间点间统计上的显著差异
Figure 1. Expression profile of clock genes in the brain of H. kuda
The presence of cosine waves indicates clear Biorhythms in the expression of each gene; The black and white bars on the X-axis indicate the late light phase and light-on in the photoperiod; Uppercase letters indicate that statistically significant differences between genes at each sampling time point
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图 2 各组海马肝脏钟基因的24h表达谱
余弦波的存在表明各基因的表达存在明显的生物节律性; X轴上黑白色条表示光周期中的光暗期和光亮期;不同字母表示各基因在各采样时间点间统计上的显著差异
Figure 2. Expression profile of clock genes in the liver of H. kuda
The presence of cosine waves indicates clear Biorhythms in the expression of each gene; The black and white bars on the X-axis indicate the late light phase and light-on in the photoperiod; Uppercase letters indicate that statistically significant differences between genes at each sampling time point
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图 3 各组海马肝脏脂类代谢相关基因的24h表达谱
余弦波的存在表明各基因表达存在明显的节律性; X轴上黑白色条表示光周期的光暗期和光亮期; 不同字母表示各基因在各采样时间点间统计上的显著差异
Figure 3. Expression profile of lipid metabolic genes in the brain of H. kuda
The presence of cosine waves indicates clear Biorhythms in the expression of each gene; The black and white bars on the X-axis indicate the late light phase and light-on in the photoperiod; Uppercase letters indicate that statistically significant differences between genes at each sampling time point
表 1 用于实时荧光定量PCR的有关引物及其退火温度(Tm)
Table 1 Sequences and annealing temperature (Tm) of primer pairs used for quantitative PCR
基因名称Gene 引物序列Sequences (5′—3′) 退火温度Tm (℃) 钟基因Clock gene Bmal1 TCAGTCAAGCGGAAATGGCT
ACAATGTCACGAAGGACGCT60 Clock GAGCCTGAACGTGGCTCTAC
TGTGGATCTTGTTGCTCTGC59 Cry1 CCCAGCAAAGACTCCTTGAG
CAGTCAAAGGCCATTTCCAT59 Cry2 GCAGCTCCTCAAACACCTTC
GGGATCAAAATCCAGAAGCA60 Per1 GAGGACTCCTGGTGCTTGAG
GTTCAAGGACCTCAGCAAGC59 Per2 TCTTTGCCTTAGCCGACTGT
CCGCTCTACACGAGTCATCAPer3 CAAGCAAGTGCAAGCCAATA
TGCAGCACAGGATACTGGAG60 转录因子基因Transcription factor gene Srebp1 TGCAGCAATCCAATCAGAAG
CACGTTTGGCTTGGTATCCT60 Srebp2 CAGACCAGGTCCAGTTTGGT
CCACCCAAGATTTTGCAACT59 脂类代谢基因Lipid metabolism gene Hmgcr GATCCCGATGACCAGACACT
GAGAGCTGACCGGTCTCAAC59 Mvk ACCGAGTCCAGCACAGAAGT
GCATGCTGAGGTTCTTAGCC60 Mvd TCGATGGACCAGATTGATGA
TCGCTGAACTCACCATGAAG60 Lss ATGGTGGCGTAGTCTTGGAC
TGTACCTCCCCATGAGCTTC60 Fdfs TGCTGTCATGAGGTCCAGAG
GGATGGAATTGGTTTGGATG59 Cetp GCCTGGTTATCTCGGTTTCA
CCTCTGGCCAACTATGGTGT60 Scap CCAGACCTCCTCGTCTTCAG
GAGATCCGACCAGCACTCTC60 
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表 2 不同处理中海马生长的比较
Table 2 Comparison of growth index of H. kuda in different treatments
生长指标
Growth indexG1 G2 G3 G4 初始体长 (cm) 4.99±0.25 4.98±0.17 4.99±0.35 4.98±0.18 初始体重 (g) 0.59±0.06 0.60±0.04 0.60±0.03 0.60±0.04 终体长 (cm) 8.88±0.14 8.24±0.13 7.12±0.15 7.42±0.16 终体重 (g) 2.51±0.13 1.97±0.11 1.21±0.14 1.31±0.12 SGRL (%/d) 2.06±0.18A 1.80±0.14B 1.28±0.27C 1.42±0.16D SGRW (%/d) 5.20±0.38A 4.27±0.25B 2.53±0.34C 2.82±0.25D CF (g/cm3) 0.36±0.01A 0.35±0.02A 0.34±0.02B 0.32±0.02C 注: 同行的不同字母代表组间存在显著性差异(P<0.05)Note: Different letters in the same row indicate significant differences (P<0.05)
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表 3 中枢钟系统与周围钟系统间表达的协同性比较
Table 3 Comparison of the expressed synergy between the central and the peripheral clock system
Clock Bmal1 Per1 Per2 Per3 Cry1 组别
Group来源
Origin顶相/
低谷顶相/
低谷顶相/
低谷顶相/
低谷顶相/
低谷顶相/
低谷G1 脑 6/19 9/19 11/21 10/21 7/18 10/23 肝 6/20 9/21 11/21 10/22 8/19 10/22 G2 脑 9/21 8/20 10/20 10/22 6/18 6/18 肝 12/24 16/6 17/6 16/5 14/4 16/5 G3 脑 5/16 10/22 9/24 8/20 5/18 8/19 肝 9/19 9/20 10/23 11/21 9/18 8/19 G4 脑 10/21 10/20 11/22 11/21 10/21 11/22 肝 11/23 14/4 15/5 18/7 16/6 14/23or5
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