GENE DIFFERENCE EXPRESSION OF CHOLESTEROL AND BILE ACID METABOLISM PATHWAY IN INTESTINAL MUCOSA WITH THE CYHV-2 DISEASE CARASSIUS AURATUS GIBELIO
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摘要: 为了探讨CyHV-2疾病条件下异育银鲫胆汁酸肠肝循环代谢途径主要基因表达活性的变化, 以患CyHV-2病的、正常的异育银鲫肠道黏膜为材料, 提取总RNA, 采用RNA-Seq测序、对单一基因进行注释, 并进行KEGG富集分析、单一基因差异表达分析。结果显示, 肠道黏膜组织有7770个基因显著性差异表达, 其中, 差异表达上调基因数为3335个、差异表达下调的基因数为4435个, 表明CyHV-2病的发生对肠道黏膜组织基因表达产生了重大的影响。病鱼胆固醇、胆汁酸生物合成代谢途径的酶、蛋白质的基因显著性差异表达, 显示肠道黏膜胆固醇、胆汁酸合成代谢受到显著性影响。参与胆固醇、胆汁酸合成代谢调节作用, 以及胆固醇、胆汁酸分泌、吸收、转运等生理过程的蛋白质、酶的基因也是差异表达下调, 胆汁酸肠肝循环有出现代谢障碍的趋势。结果表明, CyHV-2病的发生对肠道黏膜组织基因表达产生了严重影响, 对胆固醇、胆汁酸的合成代谢途径、胆汁酸肠肝循环途径的基因表达产生了严重影响, 将导致病鱼体内胆固醇、胆汁酸量的不足。患CyHV-2病病鱼血清胆汁酸含量下降了99%、胆固醇含量下降了10%, 证实了上述基因差异表达的趋势。Abstract: Gibel carp (Carassius auratus gibelio) infected with Cyprinid herpesvirus 2 (CyHV-2), damaged many organs including intestinal mucosa. Total RNA of intestinal mucosa from CyHV-2 diseased and normal gibel carp were extracted for RNA-Seq. Transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome was conducted by Trinity (version: v2012-10-05, min_kmer_cov 2) software. Single gene is annotated by using different databases. Software and the database of the functional gene annotation are SwissProt (NCBI blast 2.2.27+, Blast2GO v2.5), KOG (NCBI blast 2.2.27+), PFAM (HMMER 3.0 package), KEGG (KOBAS, NCBI blast 2.2.27+). Gene expression was analyzed by edgeR package. 3335 up-regulated genes and 4435 down-regulated genes were observed, indicating a significant injury in the intestinal mucosa by CyHV-2 infection. The metabolic disorder for enterohepatic circulation of bile acids was supported by the reduced gene expression that regulate cholesterol and bile acid synthesis metabolism and other physiological processes, secretion, absorption and transportation. As a consequence, CyHV-2 infection in Crucian carp decreased the serum bile acid content by 99% and cholesterol content by 10%.
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Keywords:
- Oxidized fish oil /
- Mucosa /
- Cholesterol /
- Bile acid /
- Gibel carp
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小黄鱼(Larimichthys polyactis)和大黄鱼(Larimichthys crocea), 均属鲈形目(Perciformes)、石首鱼科(Sciaenidae)、黄鱼属(Larimichthys), 是我国重要经济鱼类, 其肉质细嫩、味道鲜美, 深受消费者青睐。大黄鱼人工繁殖开始于20世纪80年代后期, 2023年其养殖产量达28.10万吨, 在全国海水养殖鱼类中位居第二; 小黄鱼以捕捞为主, 2023年捕捞产量为26.73万吨, 在我国“四大海产”中仅次于带鱼, 目前, 小黄鱼全人工繁育关键技术成功突破, 并已实现规模化繁育[1—3]。大黄鱼主要分布于黄海、东海和南海, 其个体大, 为两年性成熟, 第一年生长速度较慢; 小黄鱼主要分布于渤海、黄海、东海及朝鲜半岛西部, 其当年生长速度较快, 但二龄的小黄鱼体质量远远小于同期的大黄鱼[4]。
通过杂交育种, 可获得在生长、肌肉品质及抗逆性等方面超越亲本的优良新性状, 获得杂种优势[5, 6]。我们利用小黄鱼和大黄鱼进行种间杂交, 成功获得了正交F1 (小黄鱼♀×大黄鱼♂)和反交F1 (大黄鱼♀×小黄鱼♂)[7, 8]。在生长性状方面, 12月龄反交F1的生长速度最快, 表现出超亲生长优势, 正交F1的生长速度介于父母本之间, 表现出中亲生长优势。在肌肉品质方面, 已有研究表明, 舟山地域12月龄正交F1与双亲相比具有一定的杂种优势, 其氨基酸种类丰富, EAA和不饱和脂肪酸(UFA, Unsaturated fatty acid)含量较高, 具有较高食用价值[9]。然而, 鱼类肌肉营养品质受其规格大小、所处地域和饵料来源等的影响[10], 在同一养殖条件下, 小黄鱼、大黄鱼及其正反杂交种的肌肉营养成分及组织学结构也尚未报道。因此, 本研究对15月龄宁波象山地域小黄鱼、大黄鱼、正交F1及反交F1进行了肌肉营养成分分析及品质评价, 以期挖掘杂交黄鱼优势, 为杂交黄鱼的推广和利用提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
实验用小黄鱼、大黄鱼、正交F1和反交F1经人工催产、授精获得, 养殖于浙江省宁波市象山港湾水产苗种有限公司。养殖期间投喂天邦全熟化水产配合饲料, 其营养成分: 粗蛋白质≥35.00%, 粗脂肪≥3.00%, 粗纤维≤8.00%, 粗灰分≤16.00%, 水分≤12.00%, 总磷≥0.50%, 赖氨酸≥1.70%。同池饲养至15月龄, 分别在每个群体中随机选取30尾体质健壮、无外伤的个体取样, 共取120尾, 不同群体体质量介于60—110 g。
1.2 肌肉组织学分析
组织切片: 分别取小黄鱼、大黄鱼、正交F1和反交F1背部肌肉放入多聚甲醛中固定24h, 经石蜡包埋、切片, 先后使用苏木精和伊红染液对细胞核和细胞质进行染色, 脱水后用中性树胶封片, 使用DM4 B荧光显微镜(徕卡, 德国)观察不同群体肌肉组织结构。
肌纤维直径与密度测定: 使用Image-Pro Plus软件对单个肌纤维长径和短径、单个视野面积及肌纤维根数进行测量、计数, 并根据《DB32/T 1824-2011》中公式计算各群体肌纤维直径和密度。
1.3 营养指标测定
每个群体设5组平行, 每组6尾实验鱼。取样前使用MS222将实验鱼麻醉, 去皮取背部两侧肌肉, 将每组实验鱼肌肉绞碎并混合均匀, 用于肌肉营养成分分析。水分含量采用直接干燥法测定, 参照《GB 5009.3-2016》; 粗灰分采用高温炉550℃灼烧法测定, 参照《GB 5009.4-2016》; 粗蛋白采用半微量凯氏定氮法测定, 参照《GB 5009.5-2016》; 粗脂肪采用索氏抽提法测定, 参照《GB 5009.6-2016》; 氨基酸采用氨基酸自动分析仪测定, 参照《GB 5009.124-2016》; 脂肪酸采用气相色谱法测定, 参照《GB 5009.168-2016》; 矿物元素采用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)测定, 参照《GB 5009.268-2016》。
1.4 营养品质评价及数据分析
根据联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)建议的氨基酸评分模式[11]和中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所提出的全鸡蛋蛋白的氨基酸模式[12], 按照以下公式计算四种黄鱼群体氨基酸评分(AAS, Amino acid score)、化学评分(CS, Chemical score)和EAAI[13, 14]。
氨基酸含量(mg/g N)=样品肌肉氨基酸百分含量×6.25×1000/样品肌肉粗蛋白百分含量
$$ \mathrm{A}\mathrm{A}\mathrm{S}=\frac{\mathrm{样}\mathrm{品}\mathrm{必}\mathrm{需}\mathrm{氨}\mathrm{基}\mathrm{酸}\mathrm{含}\mathrm{量}(\mathrm{m}\mathrm{g}/\mathrm{g}\;\mathrm{N})}{\mathrm{F}\mathrm{A}\mathrm{O}\mathrm{评}\mathrm{分}\mathrm{模}\mathrm{式}\mathrm{相}\mathrm{应}\mathrm{必}\mathrm{需}\mathrm{氨}\mathrm{基}\mathrm{酸}\mathrm{含}\mathrm{量}(\mathrm{m}\mathrm{g}/\mathrm{g}\;\mathrm{N})} $$ $$ \mathrm{C}\mathrm{S}=\frac{\mathrm{样}\mathrm{品}\mathrm{必}\mathrm{需}\mathrm{氨}\mathrm{基}\mathrm{酸}\mathrm{含}\mathrm{量}(\mathrm{m}\mathrm{g}/\mathrm{g}\;\mathrm{N})}{\mathrm{鸡}\mathrm{蛋}\mathrm{蛋}\mathrm{白}\mathrm{质}\mathrm{中}\mathrm{相}\mathrm{应}\mathrm{必}\mathrm{需}\mathrm{氨}\mathrm{基}\mathrm{酸}\mathrm{含}\mathrm{量}(\mathrm{m}\mathrm{g}/\mathrm{g}\;\mathrm{N})}\;\; $$ $$ \mathrm{E}\mathrm{A}\mathrm{A}\mathrm{I}=\sqrt[\uproot{18}{{n}}]{\frac{100\mathrm{A}}{\mathrm{A}\mathrm{E}}\times \frac{100\mathrm{B}}{\mathrm{B}\mathrm{E}}\cdots \cdots \times \frac{100\mathrm{H}}{\mathrm{H}\mathrm{E}}}\qquad \qquad \quad\;\;\;\;\; $$ 式中, n为待测的必需氨基酸个数, A, B, ···, H为样品必需氨基酸含量, AE, BE, ···, HE为鸡蛋蛋白质中相应必需氨基酸含量。
采用Excel 2016和SPSS 19.0软件对实验数据进行处理, 单因素方差分析(One-way ANOVA)进行显著性分析, 结果以平均值±标准差表示, 差异显著性水平为P<0.05。
2. 结果
2.1 组织学结构
如图 1所示, 肌纤维呈紫红色, 形态正常, 由白色肌内膜分隔成网状结构。各群体相比, 大黄鱼肌纤维排列最为致密, 为536.50 根/mm2, 显著高于小黄鱼、正交F1和反交F1 (P<0.05)。与双亲相比, 正交F1肌纤维直径显著升高(P<0.05), 反交F1肌纤维直径则无显著性差异(P>0.05)。相比之下, 小黄鱼和大黄鱼肌纤维大小更加一致(表 1)。
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图 1 四个黄鱼群体肌肉组织学结构a. 小黄鱼; b. 大黄鱼; c. 正交F1; d. 反交F1; MF. 肌纤维; EM. 肌内膜Figure 1. Histological structure of muscle tissue in four populations of yellow croakera. L. polyactis; b. L. crocea; c. L. polyactis ♀ × L. crocea ♂; d. L. crocea ♀ × L. polyactis ♂; MF. Muscle fiber; EM. Endomysium表 1 四个黄鱼群体肌肉纤维直径和密度Table 1. Muscle fiber diameter and density in four yellow croaker populations指标Index 小黄鱼L. polyactis 大黄鱼L. crocea 正交F1 L.
polyactis ♀ ×
L. crocea ♂反交F1 L.
crocea ♀ ×
L. polyactis ♂直径Diameter (μm) 42.09±
12.24b41.88±
12.41b49.17±
17.51a44.44±
19.13ab密度Density (根/mm2) 377.31±
46.77b536.50±
31.96a367.74±
17.36b363.65±
27.34b注: 同行数据上标字母不同表示差异显著(P<0.05); 下同Note: Different superscript letters in the same row indicate significant differences (P<0.05); The same applies below 2.2 常规营养成分
四个黄鱼群体肌肉中水分、粗灰分、粗蛋白和粗脂肪含量如表 2所示。其中, 正交F1 (72.70%)和反交F1 (72.58%)水分含量显著低于小黄鱼(74.17%)和大黄鱼(73.74%; P<0.05); 粗灰分含量(3.14%和3.18%)显著低于大黄鱼(3.66%; P<0.05), 而与小黄鱼无显著差异(P>0.05); 正交F1 (16.88%)和反交F1 (16.93%)粗蛋白含量显著高于小黄鱼(16.13%)和大黄鱼(16.01%; P<0.05); 粗脂肪含量(5.03%和5.12%)显著高于小黄鱼(4.73%; P<0.05), 显著低于大黄鱼(5.37%; P<0.05)。
表 2 四个黄鱼群体肌肉常规营养成分比较Table 2. Comparison of conventional nutritional components in the muscles among four populations of yellow croaker (wet weight, %)群体
Population水分
Moisture粗灰分
Crude Ash粗蛋白
Crude protein粗脂肪
Crude fat小黄鱼
L. polyactis74.17±0.05a 3.07±0.02b 16.13±0.02b 4.73±0.04d 大黄鱼
L. crocea73.74±0.04b 3.66±0.09a 16.01±0.02c 5.37±0.03a 正交F1
L. polyactis ♀ ×
L. crocea ♂72.70±0.03c 3.14±0.02b 16.88±0.03a 5.03±0.02c 反交F1
L. crocea ♀ ×
L. polyactis ♂72.58±0.09c 3.18±0.02b 16.93±0.03a 5.12±0.02b 注: 同列数据上标字母不同表示差异显著(P<0.05); 下同Note: Different superscript letters in the same column indicate significant differences (P<0.05); the same applies below 2.3 氨基酸组成
在四个黄鱼群体中共检测到17种氨基酸, 其中EAA 7种, 包括缬氨酸(Val)、甲硫氨酸(Met)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、苏氨酸(Thr)、苯丙氨酸(Phe)和赖氨酸(Lys), EAA中除Val外, 其余氨基酸在正交F1和反交F1中的含量均显著高于双亲(P<0.05); 在10种非必需氨基酸(NEAA, Non-essential amino acid: 天冬氨酸Asp、酪氨酸Tyr、丝氨酸Ser、谷氨酸Glu、脯氨酸Pro、甘氨酸Gly、丙氨酸Ala、胱氨酸Cys、组氨酸His和精氨酸Arg)中, Gly和His在四个群体中无显著性差异, Ser在正交F1中的含量显著高于双亲(P<0.05), 在反交F1中显著高于小黄鱼(P<0.05), 其余7种氨基酸在正交F1和反交F1中的含量均显著高于双亲(P<0.05)。总体而言, 正交F1和反交F1 TAA、TEAA和非必需氨基酸总量(TNEAA, Total non-essential amino acid)均显著高于双亲(P<0.05); 正交F1 TDAA显著高于小黄鱼(P<0.05), 与大黄鱼无显著性差异(P>0.05), 反交F1显著高于双亲(P<0.05); 反交F1 EAA/TAA值和EAA/NEAA值最高, 显著高于其双亲及正交F1 (P<0.05; 表 3)。
表 3 四个黄鱼群体肌肉氨基酸组成Table 3. Amino acid composition in the muscles of four yellow croaker populations (Dry weight, g/100 g)氨基酸类别
Amino acid species氨基酸名称
Amino acid name小黄鱼
L. polyactis大黄鱼
L. crocea正交F1
L. polyactis ♀ ×
L. crocea ♂反交F1
L. crocea ♀ ×
L. polyactis ♂非必需氨基酸NEAA 天冬氨酸Asp* 7.78±0.04b 7.86±0.03b 7.99±0.02a 8.06±0.04a 酪氨酸Tyr 2.64±0.02b 2.57±0.03b 2.72±0.01a 2.74±0.37a 丝氨酸Ser 3.27±0.02c 3.32±0.03b 3.43±0.01a 3.36±0.00b 谷氨酸Glu* 11.76±0.04c 11.79±0.02c 12.12±0.03b 12.90±0.02a 脯氨酸Pro 2.38±0.02c 2.41±0.02c 2.55±0.03b 2.63±0.00a 甘氨酸Gly* 3.53±0.03 3.76±0.02 3.44±0.45 3.73±0.02 丙氨酸Ala* 4.36±0.02c 4.42±0.02c 4.62±0.02b 4.71±0.02a 胱氨酸Cys 0.47±0.01b 0.47±0.02b 0.54±0.01a 0.53±0.00a 组氨酸His 1.62±0.04 1.54±0.02 1.62±0.02 1.65±0.05 精氨酸Arg 4.52±0.03b 4.50±0.03b 4.69±0.03a 4.62±0.03a 必需氨基酸EAA 缬氨酸Val 3.85±0.02 3.84±0.03 3.92±0.02 3.87±0.03 甲硫氨酸Met 2.18±0.05b 2.09±0.02b 2.30±0.03a 2.33±0.03a 异亮氨酸Ile 3.48±0.03c 3.49±0.01c 3.69±0.02a 3.57±0.02b 亮氨酸Leu 6.14±0.02c 6.17±0.03c 6.32±0.02b 6.38±0.01a 苏氨酸Thr 3.39±0.02b 3.36±0.02b 3.47±0.03a 3.49±0.05a 苯丙氨酸Phe 3.04±0.02b 3.09±0.02b 3.31±0.02a 3.26±0.02a 赖氨酸Lys 7.26±0.02c 7.31±0.02c 7.53±0.03a 7.44±0.04b 氨基酸总量TAA 71.68±0.06c 72.01±0.11c 74.26±0.52b 75.28±0.22a 必需氨基酸总量TEAA 29.34±0.02b 29.34±0.11b 30.54±0.01a 30.34±0.13a 非必需氨基酸总量TNEAA 42.34±0.08c 42.67±0.05c 43.73±0.53b 44.93±0.10a 呈味氨基酸总量TDAA 27.44±0.09c 27.83±0.78bc 28.17±0.48b 29.41±0.07a EAA/TAA (%) 40.94±0.06a 40.75±0.09a 41.12±0.29a 40.31±0.05b EAA/NEAA (%) 69.31±0.18a 68.77±0.27a 69.85±0.85a 67.53±0.15b 注: *呈味氨基酸Note: *delicious amino acid 2.4 氨基酸组成评价
必需氨基酸组成评价结果显示, 四个黄鱼群体中AAS均大于1, 高于FAO/WHO标准。小黄鱼和大黄鱼中Lys评分最高(2.15和2.18), 含硫氨基酸(Met+Cys)最低(1.21和1.18); 正交F1和反交F1中Lys评分最高(2.21和2.18), Val最低(1.26和1.25)。根据CS评分结果, 四个黄鱼群体中除Val和Met+Cys外, 其余EAA含量均高于鸡蛋蛋白, 其中Met+Cys为第一限制性氨基酸。四个黄鱼群体EAAI均大于100, 不同群体间EAAI存在差异, 比较而言, 正交F1>反交F1>大黄鱼>小黄鱼(表 4)。
表 4 四个黄鱼群体肌肉必需氨基酸组成评价Table 4. Evaluation of the essential amino acid composition in the muscles of four yellow croaker populations氨基酸
Amino acidFAO评分模式
FAO scoring pattern
(mg/g N)鸡蛋蛋白
Egg protein
(mg/g N)小黄鱼
L. polyactis大黄鱼
L. crocea正交F1
L. polyactis ♀ ×
L. crocea ♂反交F1
L. crocea ♀ ×
L. polyactis ♂AAS CS AAS CS AAS CS AAS CS 缬氨酸Val 310 411 1.25 0.94 1.26 0.94 1.26 0.95 1.25 0.94 甲硫氨酸＋胱氨酸Met＋Cys 220 386 1.21 0.69 1.18 0.67 1.29 0.74 1.29 0.74 异亮氨酸Ile 250 331 1.40 1.06 1.42 1.07 1.47 1.11 1.42 1.07 亮氨酸Leu 440 534 1.41 1.16 1.42 1.17 1.44 1.18 1.45 1.19 苏氨酸Thr 250 292 1.37 1.17 1.36 1.17 1.39 1.19 1.39 1.19 苯丙氨酸＋酪氨酸Phe＋Tyr 380 565 1.51 1.01 1.51 1.02 1.59 1.07 1.57 1.06 赖氨酸Lys 340 441 2.15 1.66 2.18 1.68 2.21 1.71 2.18 1.68 必需氨基酸指数EAAI 106.69 106.91 110.42 109.46 2.5 脂肪酸组成
四个黄鱼群体肌肉中脂肪酸的组成及含量见表 5, 共检测出22种脂肪酸, 包括7种饱和脂肪酸(SFA, Saturated fatty acid)、7种单不饱和脂肪酸(MUFA, Monounsaturated fatty acid)和8种多不饱和脂肪酸(PUFA, Polyunsaturated fatty acids)。除C15﹕0、C20﹕0、C17﹕1、C20﹕1n-9和C22﹕1外, 其余17种脂肪酸含量在四种黄鱼群体中均具有显著性差异(P<0.05)。两种杂交黄鱼中C17﹕0和C22﹕6n-3 (DHA)含量最高。就总量而言, 正交F1和反交F1中ΣSFA、ΣMUFA含量显著高于小黄鱼(P<0.05); 反交F1中ΣPUFA含量显著低于双亲(P<0.05), 正交F1中ΣPUFA含量显著低于小黄鱼(P<0.05)。四种黄鱼群体PUFA/SFA值介于0.51—0.57, 均高于理想脂肪酸的推荐值。
表 5 四个黄鱼群体肌肉脂肪酸组成及含量Table 5. Fatty acid composition and content in the muscles of four yellow croaker populations (%)脂肪酸
Fatty acid小黄鱼
L. polyactis大黄鱼
L. crocea正交F1 L.
polyactis ♀ ×
L. crocea ♂反交F1 L.
crocea ♀ ×
L. polyactis ♂SFA C14﹕0 3.08±0.02c 3.37±0.04a 3.21±0.02b 3.26±0.01b C15﹕0 0.40±0.02 0.41±0.01 0.40±0.02 0.41±0.01 C16﹕0 26.85±0.05a 26.75±0.06a 26.48±0.05b 26.53±0.03b C17﹕0 0.42±0.00c 0.44±0.01b 0.49±0.00a 0.48±0.00a C18﹕0 5.49±0.05d 5.73±0.03c 6.08±0.04a 5.90±0.03b C20﹕0 0.27±0.01 0.28±0.01 0.29±0.00 0.29±0.01 C22﹕0 0.14±0.00a 0.16±0.00a 0.12±0.01b 0.13±0.00b ΣSFA 36.65±0.03b 37.13±0.04a 37.07±0.07a 37.00±0.04a MUFA C14﹕1 0.68±0.06b 1.55±0.57a 2.10±0.09a 2.08±0.07a C16﹕1 11.02±0.03b 11.32±0.03a 10.42±0.02d 10.59±0.04c C17﹕1 0.25±0.01 0.27±0.01 0.25±0.00 0.26±0.01 C18﹕1n-9c 29.73±0.03b 30.03±0.14a 30.28±0.11a 30.27±0.06a C20﹕1n-9 0.25±0.01 0.23±0.00 0.23±0.01 0.23±0.02 C22﹕1 0.14±0.00 0.13±0.00 0.13±0.00 0.13±0.00 C24﹕1n-9 0.35±0.01c 0.37±0.00bc 0.40±0.01a 0.39±0.00ab ΣMUFA 42.42±0.05b 43.91±0.44a 43.81±0.07a 43.94±0.10a PUFA C18﹕2n-6c 7.82±0.05a 6.62±0.05b 6.40±0.02c 6.34±0.07c C22﹕2 0.22±0.01c 0.35±0.01a 0.33±0.01a 0.26±0.01b C18﹕3n-6 0.42±0.02b 0.57±0.00a 0.56±0.01a 0.54±0.01a C18﹕3n-3 0.75±0.02a 0.70±0.01b 0.67±0.02b 0.67±0.01b C20﹕4 0.93±0.01a 0.84±0.03b 0.92±0.01a 0.93±0.00a C20﹕5n-3 (EPA) 3.78±0.02a 3.50±0.04b 3.22±0.03c 3.27±0.05c C22﹕5n-3 1.00±0.02a 0.88±0.02c 0.92±0.00b 0.94±0.00b C22﹕6n-3 (DHA) 6.01±0.02b 5.83±0.05c 6.10±0.03a 6.12±0.02a ΣPUFA 20.93±0.08a 19.30±0.07b 19.12±0.05bc 19.06±0.07c PUFA/SFA 0.57 0.52 0.51 0.52 2.6 矿物质组成
四个黄鱼群体均检测出4种常量元素(K、Na、Mg和Ca)和6种微量元素(Mn、Zn、Fe、Se、Cu和Cr)。常量元素中K含量最高, 这与吴靖娜等[15]的研究结果一致, 两种杂交黄鱼中Ca含量与大黄鱼接近, 并显著高于小黄鱼。微量元素中Fe和Zn含量最高, Cr含量最低, 正交F1和反交F1中Fe含量显著高于双亲(P<0.05), Zn含量显著高于小黄鱼(P<0.05; 表 6)。
表 6 四个黄鱼群体肌肉矿物质组成及含量Table 6. Mineral elements composition and content in the muscles of four yellow croaker populations矿物质
Mineral element (mg/kg)小黄鱼
L. polyactis大黄鱼
L. crocea正交F1
L. polyactis ♀ × L. crocea ♂反交F1
L. crocea ♀ × L. polyactis ♂常量元素
MacroelementK 9667.87±23.25a 9847.96±29.39a 9259.01±53.72b 9304.61±2.91b Na 885.56±1.38a 879.13±4.22a 818.42±5.26b 849.42±4.25ab Mg 911.23±3.94a 884.89±1.59b 870.53±3.02b 866.19±1.81b Ca 855.43±7.58b 981.09±4.27a 993.62±8.31a 998±2.44a 微量元素
MicroelementMn 1.92±0.01a 1.89±0.01ab 1.82±0.01b 1.72±0.01c Zn 19.03±0.06b 19.4±0.03ab 19.77±0.04a 19.66±0.07a Fe 23.06±0.07c 23.73±0.01b 24.75±0.06a 24.44±0.06a Se 0.74±0.00a 0.68±0.00b 0.75±0.01a 0.75±0.01a Cu 4.37±0.03b 4.63±0.02a 3.96±0.02c 3.96±0.02c Cr 0.00065±0.00a 0.00066±0.00a 0.00054±0.00b 0.00063±0.00ab 3. 讨论
3.1 肌肉组织学
肌纤维直径和密度影响肌肉的质构特性, 是决定鱼肉质地的最主要因素[16, 17]。一般肌纤维的密度越高, 肌肉硬度越大[18], 肌纤维直径越小, 肉质越细嫩[19]。本研究结果显示, 正交F1和反交F1肌纤维密度显著低于大黄鱼而与小黄鱼无显著差异, 表明其肌肉硬度更接近于小黄鱼; 正交F1肌纤维直径显著高于双亲, 而反交F1肌纤维直径与双亲无显著差异, 表明反交F1嫩度与双亲无差异但优于正交F1。此外, 有研究表明, 肌纤维直径大、纤维密度低可以增加肌肉蛋白质含量和鲜味物质浓度[20], 这与本研究结果相符。
3.2 常规营养成分
肌肉中蛋白质和脂肪含量是衡量鱼类营养价值的两个重要指标。本研究首次对15月龄小黄鱼、大黄鱼及其正反杂交种肌肉营养成分进行了测定, 结果表明, 正交F1和反交F1蛋白质含量均显著高于双亲, 表现出杂种优势。四个黄鱼群体脂肪含量介于4.73%—5.37%, 属中脂鱼类[21]。鱼肉中水分含量与脂肪含量成反比[22, 23], 这与本研究结果一致。与已有研究报道相比, 本研究中小黄鱼、大黄鱼和正交F1蛋白质和脂肪含量与刘峰等[9]的研究结果相近; 小黄鱼蛋白质含量高于高学慧等[24]、低于于琴芳等[25]的研究结果, 脂肪含量高于高学慧等[24]和于琴芳等[25]的研究结果; 大黄鱼蛋白质含量低于吴靖娜等[15]和颜霖等[26]的研究结果, 脂肪含量低于吴靖娜等[15]的研究结果, 与颜霖等[26]的研究结果相当。导致这一差异的原因可能与所取样品的规格大小、地理位置、生长季节和饵料来源等有关。
3.3 氨基酸组成及品质评价
氨基酸组成与含量是评价鱼肉产品营养价值的重要指标, EAA决定蛋白质的营养价值, 而DAA在一定程度上决定着肉质是否鲜美[27]。两种杂交黄鱼肌肉TDAA (28.17和29.41 g/100 g)均显著高于小黄鱼(27.44 g/100 g)和大黄鱼(27.83 g/100 g)。在DAA中, Asp和Glu是呈鲜味的特征性氨基酸, Glu的鲜味最强, 而Gly和Ala是呈甘味的特征性氨基酸[9]。除Gly外, 其余3种DAA在杂交黄鱼中的含量均显著高于双亲, 且Glu在所有氨基酸组成中含量最高, 说明四种黄鱼味道鲜美, 而杂交黄鱼鲜度更高。杂交黄鱼及其亲本肌肉中共检测到7种EAA (Val、Met、Ile、Leu、Thr、Phe和Lys), 种类丰富, 含量高。除Val外, 其他EAA种类及TEAA在两种杂交黄鱼中均显著高于双亲。鱼类是优质蛋白质的极佳来源, 尤其是Lys和Met[22]。四种黄鱼肌肉中Lys在EAA中含量最高(7.26—7.53 g/100 g), 可以弥补谷物中Lys的不足, 从而提高人体对蛋白质的利用率, 比较而言, 杂交黄鱼较双亲具有更高的营养价值。四个黄鱼群体EAA/TAA值为40.31%—41.12%, EAA/NEAA值为67.53%—69.85%, 高于FAO/WHO推荐的理想蛋白质模式(EAA/TAA≥40%, EAA/NEAA≥60%), 属于优质的食用蛋白质。AAS、CS和EAAI是评价食物蛋白质营养价值的重要指标, 四个黄鱼群体AAS均大于1, 高于FAO/WHO标准, 其中比值最高的是Lys, 这与于琴芳等[25]的研究结果一致。EAAI值均大于100, 但正交F1和反交F1 EAAI值较双亲更高, 表明杂交黄鱼更接近标准蛋白质的必需氨基酸比例, 更易被人体消化吸收。
3.4 脂肪酸评价
脂肪酸可以为人体提供能量来源、促进新陈代谢, 是人体机能关键的组成部分。根据碳氢链饱和与不饱和程度可将其分为SFA、MUFA和PUFA三大类。在本研究中, 四个黄鱼群体的脂肪酸种类丰富, UFA含量高于SFA, SFA、MUFA和PUFA分别以C16﹕0、C18﹕1n-9c和C18﹕2n-6c含量最高。脂肪酸组成对食品的风味有一定的影响, 有研究表明, SFA和MUFA与风味、嫩度及多汁性呈显著正相关[28]。两种杂交黄鱼的SFA和MUFA含量与大黄鱼相当, 且均显著高于小黄鱼, 说明杂交种的风味得到有效改善, 具有较高的食用价值。DHA和EPA是人体必需脂肪酸, 需要通过食物供给, 二者在促进大脑发育、增强记忆力、预防心血管疾病和免疫调节等方面具有重要作用[29]。四个黄鱼群体肌肉中DHA和EPA含量丰富, 占PUFA总量的46.77%—49.27%, 其中DHA含量在两种杂交黄鱼中显著高于双亲及高学慧等[24]对小黄鱼的研究结果, 具有较高的保健价值。PUFA/SFA值是评价鱼类营养价值的重要指标之一, 四个黄鱼群体中该比值分别为0.51、0.52、0.57和0.52, 均高于联合国健康部门的推荐值(0.40), 具有理想的脂肪酸组成。
3.5 矿物质组成
水生动物可较强富集来自于水环境和饵料中的矿物质元素, 并通过膳食补充给人体, 以维持人体正常的生理机能[30]。在本研究中, 常量元素K、Na、Mg和Ca在四个黄鱼群体中均被检出, 各元素含量在不同群体中存在显著差异, 两种杂交黄鱼中Ca元素含量高于双亲, 而K、Na和Mg含量低于双亲。微量元素中Fe含量最高, 其次是Zn, 二者在两种杂交黄鱼中的含量均高于双亲。矿物质元素会影响鱼肉的货架期和风味, 如Fe可以防止机体脂类氧化、保持肉味[31], 杂交黄鱼中Fe元素丰富对肌肉品质的提高具有重要作用。除此之外, Ca元素是骨骼和牙齿的重要成分, Fe和Zn能够促进生长发育、抵抗疾病[32]。因此, 杂交黄鱼可作为人体补充Ca、Fe和Zn元素的良好来源, 具有很好的营养价值。
综上所述, 小黄鱼、大黄鱼及其正反杂交种肌肉蛋白质含量高, 氨基酸种类丰富, 并富含不饱和脂肪酸和矿物质元素, 具有较高的营养价值。两种杂交黄鱼获得了一定的杂交优势, 具体表现为蛋白质和EAA含量更高, 尤其是DAA和Lys等, 味道更加鲜美, 更易被人体吸收利用; 同时具有更高含量的DHA及矿物质元素(Ca、Fe和Zn)。该研究结果阐述了杂交育种对肌肉品质的影响, 可为黄鱼肉质改良及新品种培育提供重要参考。
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表 1 异育银鲫血清胆固醇和总胆汁酸含量与比较
Table 1 Gibel carp serum total cholesterol and bile acid content
指标Index 正常组(H)Normal 携带CyHV-2但无病症组(IH)Early stages 患病组(I)Illness 总胆汁酸Total bile acid (μmol/L) 13.7±5.6b 7.767±5.066ab 0.203±0.784c 与正常组比较Compared with normal group (%) – –43 –99 胆固醇Cholesterol (mmol/L) 5.447±0.562a 4.32±0.572b 4.877±1.671ab 与正常组比较Compared with normal group (%) – –21 –10 
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表 2 基因显著差异表达的KEGG路径富集
Table 2 Differentially expressed genes of KEGG enrichment
KEGG Pathway通路 Pathway ID Input number Background number 比率Ratio Pathway P-Value 类固醇合成Steroid biosynthesis ko00100 15 21 0.71 0.016 初级胆汁酸合成Primary bile acid biosynthesis ko00120 14 20 0.70 0.021
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表 3 CyHV-2病异育银鲫肠道黏膜组织胆固醇生物合成通路基因差异表达信息
Table 3 Differentially expressed genes of cholesterol biosynthetic pathway in intestinal mucosa
基因描述Gene description 基因序列长度Length log2(I/H) P-Value Cross-reference (eggNOG) 基因同源性Homology*(%) Blast_evalue 酶编号Enzyme 羟甲基-CoA合成酶Hydroxymethylglutaryl-CoA synthase, HMG-CS1 3679 –1.90 8.00E-13 KOG1393;COG3425 90① 0.00E+00 EC 2.3.3.10 HMG-CoA还原酶3-Hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase, HMG-CR 1183 –6.20 3.77E-56 KOG2480;COG1257 98① 0.00E+00 EC 1.1.1.34 甲羟戊酸激酶Mevalonate kinase, MVK 1998 –1.91 6.36E-05 KOG1511;COG1577 90① 1.00E-116 EC 2.7.1.36 磷酸甲蛋白激酶Phosphomevalonate kinase, PMVK 1360 –1.15 0.0031106 ENOG410IZWN;ENOG4111IXB 88①; 94② 1.00E-25 EC 2.7.4.2 焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶Mevalonate pyrophosphate decarboxylase, MVD 1872 –1.96 5.11E-11 KOG2833;COG3407 84①; 96③ 0.00E+00 EC 4.1.1.33 异戊烯二磷酸δ异构酶1Isopentenyl-diphosphate delta-isomerase 1, IDI1 590 –1.93 1.27E-05 KOG0142;COG1443 93①; 96③ 2.00E-114 EC 5.3.3.2 法尼焦磷酸合酶Farnesyl pyrophosphate synthase, FDPS 1864 –2.05 1.45E-14 NA 96③ 9.00E-161 EC 2.5.1.10 鲨烯合酶Squalene synthase, FDFT1 2135 –3.23 2.26E-14 KOG1459;COG1562 94③ 4.00E-74 EC 2.5.1.21 角鲨烯单加氧酶Squalene monooxygenase, SQLE 325 –5.64 6.42E-08 KOG1298;COG0654 90③; 83① 2.00E-12 EC 1.14.14.17 羊毛甾醇合成酶Lanosterol synthase, LSS 2895 –3.28 2.46E-17 KOG0497;COG1657 85①; 89② 7.00E-64 EC 5.4.99.7 δ(24)-甾醇还原酶Delta(24)-sterol reductase, DHCR24 2192 –5.37 1.01E-64 KOG1262;COG0277 97②; 94① 0.00E+00 EC 1.3.1.72 丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2A催化亚单位的α亚型Serine/threonine-protein phosphatase 2A catalytic subunit alpha isoform, PPP2CA 426 –0.37 1.46E-07 KOG0371;COG0639 100①; 100③ 3.00E-95 EC3.1.3.16 固醇4-α-羧酸甲酯3-脱氢酶Sterol-4-alpha-carboxylate 3-dehydrogenase, NSDHl 1461 –3.65 1.46E-08 KOG1430;COG0451 91①; 96③ 7.00E-59 EC 1.1.1.170 3-酮-类固醇还原酶3-Keto-steroid reductase, HSD17B7 2057 –4.05 2.14E-24 KOG1478;ENOG410XPNE 98③; 82① 6.00E-166 EC 1.1.1.270 δ(7)固醇异构酶3-Beta-hydroxysteroid-Delta(8), delta(7)-isomerase, EBP, 3-β-羟基δ(8) 1218 –5.95 1.32E-69 KOG4826;ENOG41101ES 90①; 98④ 2.00E-97 EC 5.3.3.5 固醇去饱和酶C-5 Sterol desaturase C-5, SC5D 350 –2.49 2.39E-07 KOG0872;COG3000 93①; 97③ 8.00E-65 EC 1.14.19.20 甾醇δ(7)还原酶7-Dehydrocholesterol reductase, DHCR7 2150 –2.80 4.39E-28 KOG1435;ENOG410XP67 92①; 97③ 0.00E+00 EC 1.3.1.21 固醇O-酰基转移酶2 Sterol O-acyltransferase2, SOAT2 2233 –4.31 6.46E-39 KOG0380;COG5056 93②; 78① 0.00E+00 EC 2.3.1.26 固醇O-酰基转移酶1 Sterol O-acyltransferase1, SOAT1 4448 2.29 2.05E-25 KOG0380;COG5056 89①; 94④ 0.00E+00 EC2.3.1.26 注: *进行同源性比对的物种: ①斑马鱼(Danio rerio); ②安水金线鲃(Sinocyclocheilus anshuiensis); ③犀角金线鲅(Sinocyclocheilus rhinocerous); ④滇池金线鲃(Sinocyclocheilus grahami); 下同The same applies below
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表 4 CyHV-2病的异育银鲫肠道黏膜组织胆汁酸生物合成通路基因差异表达信息
Table 4 Differentially expressed genes of bile acid biosynthesis pathway in intestinal mucosa
基因描述Gene description Gene length log2(I/H) P-Value Cross-reference (eggNOG) 同源性Homology*(%) Blast_evalue 酶编号Enzyme 胆固醇-24羟化酶Cholesterol 24-hydroxylase, CYP46A1 2132 –1.55 1.26E-10 KOG0157;COG2124 95② 8.00E-128 EC 1.14.13.98 24羟基胆固醇7-α羟化酶24-Hydroxycholesterol 7-alpha-hydroxylase, CYP39A1 2407 –8.87 2.16E-32 KOG0684;COG2124 95②; 87① 2.00E-161 EC 1.14.13.99 3β-羟基类固醇脱氢酶7 3 Beta-hydroxysteroid dehydrogenase type7, HSD3B7 2250 –1.18 2.01E-05 KOG1430;COG0451 83①; 94③ 5.00E-144 EC 1.1.1.181 胆固醇7-α单加氧酶Cholesterol 7-alpha-monooxygenase, CYP7A1 2596 –7.35 4.13E-51 KOG0684;COG2124 97③; 93① 0.00E+00 EC 1.14.13.17 7-α-羟基-4-胆甾烯-3-酮12-α-羟化酶7-Alpha-hydroxycholest-4-en-3-one 12-alpha-hydroxylase, CYP7B1 1965 –5.76 2.11E-67 KOG0684;COG2124 85①; 96③ 0.00E+00 EC 1.14.18.8 固醇26-羟化酶Sterol 26-hydroxylase, CYP27A1 440 –3.46 5.86E-26 KOG0159;COG2124 92①; 96③ 2.00E-45 EC 1.14.13.15 17-β-羟基类固醇脱氢4 17-Beta-hydroxysteroid dehydrogenase 4, HSD17B4 1996 –3.80 6.06E-46 KOG1206;COG2030 84① 0.00E+00 EC 4.2.1.107 羟戊二酰辅酶A脱氢酶Hydroxyacyl-coenzyme A dehydrogenase, HADH 2156 –2.69 7.68E-29 KOG2304;COG1250 94①; 98② 6.00E-170 EC 1.1.1.35 胆汁酸辅A Bile acid-CoA, BAAT 1917 –4.29 5.07E-64 ENOG410II3X;COG1073 92②; 83① 1.00E-70 EC 2.3.1.65
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表 5 参与胆固醇、胆汁酸代谢的蛋白质、酶基因的差异表达信息
Table 5 Differentially expressed genes of cholesterol, bile acid metabolism
基因描述Gene_description 基因序列长度Length log2(I/H) P-Value Cross-reference (eggNOG) 基因同源性Homology*(%) Blast_evalue 胆盐输出泵Bile salt export pump, BSEP 1426 –2.02 0.0250426 KOG0055;COG1132 95①; 98③ 1.00E-72 回肠钠/胆汁酸协同转运蛋白Ileal sodium/bile acid cotransporter, ASBT 2257 –8.51 8.83E-26 KOG2718;COG0385 92②; 84① 7.00E-158 低密度脂蛋白受体Low-density lipoprotein receptor, LDLR 454 –3.85 5.02E-15 ENOG410IPSW;ENOG410Z5FJ 89③; 72① 2.00E-12 胆固醇酯转移蛋白Cholesteryl ester transfer protein, CETP 2187 –1.64 1.17E-05 KOG4160;ENOG410Z88E 82①; 96② 6.00E-58 固醇调节元件结合蛋白1 Sterol regulatory element-binding protein 1, SREBF1 –2.55 0.000759 KOG2588;ENOG410XSVP 90③ ; 68① 3.00E-54 固醇调节元件结合蛋白2 Sterol regulatory element-binding protein 2, SREBP-2 1220 –1.51 4.11E-07 KOG2588;ENOG410XSVP 94③; 84① 3.00E-86 胆汁酸受体Bile acid receptor, NR1H4(FXR) 2062 2.63 2.53E-05 KOG3575;ENOG410XRZC 94③ 4.00E-15 氧固醇受体LXR-αOxysterols receptor LXR-alpha, NR1H3(LXR-α) 3707 –1.40 1.38E-07 KOG3575;ENOG410XRZC 97① 0.00E+00 磷脂酶A2Phospholipase A2, PLA2G1B 604 2.43 6.14E-32 KOG4087;ENOG411283D 93② 2.00E-50 肠胆汁酸结合蛋白Intestinal bile acid-binding protein, I-BABP 566 –7.37 7.06E-111 KOG4015;ENOG4111US8 84①; 95③ 3.00E-48 肝胆汁酸结合蛋白Liver-type fatty acid-binding protein, L-FABP 702 –5.63 3.94E-47 KOG4015;ENOG4111US8 99④; 90⑤ 4.00E-80 注: ④鲤(Cyprinus carpio); ⑤草鱼(Ctenopharyngodon idella)
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