湖北地区暴发病池塘中嗜水气单胞菌的遗传多样性和毒力特征研究
THE GENETIC DIVERSITY AND VIRULENCE CHARACTERISTICS OF AEROMONAS HYDROPHILA ISOLATED FROM FISHPONDS WITH DISEASE OUTBREAKS IN HUBEI PROVINCE
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摘要: 为了调查引起鱼类运动型气单胞菌败血症(俗称暴发病)的嗜水气单胞菌的遗传多样性和毒力特征, 阐明其流行规律, 研究于2006-2009年度从湖北省内3个不同地区的6个发病鱼塘中分离了30株嗜水气单胞菌, 其中20株为临床株(分离自血液、肝脏、肾脏或腹水), 6株为肠道株, 4株为池水株。基于所有菌株gyrB基因序列, 构建了系统发育树; 通过ERIC (Enterobacterial repetitive intergenic consensus, 肠道细菌基因间重复序列)指纹图谱进行菌株的遗传分型; 用PCR方法检测了7个毒力基因在菌株中的分布模式。这7个基因包括气溶素(aerA)、溶血素(hlyA)、热不稳定性细胞兴奋性肠毒素(alt)、热稳定性细胞兴奋性肠毒素(ast)、弹性蛋白酶(ahpB)、脂酶(lip)和鞭毛基因(fla)。此外, 以斑马鱼为感染对象, 通过腹腔注射测定了15株代表菌株的毒力。结果表明: 不同来源的20株临床株、1株肠道株和3株池水株具有相同的遗传特性, 体现为在系统树上聚为一枝, 序列相似性为100%, 具有相同的ERIC指纹图谱, 毒力基因分布模式为: aerA+hlyA+alt+ast+ahpB+lip+fla+, 且均为强毒株(LD50 9.74104cfu/尾)。与临床株相比, 其余5株肠道株和1株池水株或具有不同的ERIC指纹图谱或具有不同的毒力基因分布模式, 显示出了遗传多样性, 且毒力均弱于临床株(LD501.01106cfu/尾)。这说明在一定时间、一定区域内, 作为暴发病病原的嗜水气单胞菌为同一克隆系在流行, 不存在明显的变异或遗传多样性。此结果有助于阐明嗜水气单胞菌引起的暴发病的流行规律, 制定相应的防御措施。多种毒力基因在致病性菌株中的联合流行为发病机理的解析奠定了基础。此外, 鉴于毒力基因谱与致病性之间的相关性, 表明毒力基因可作为标记基因, 用于致病性菌株的检测。Abstract: to investigate the genetic diversity and virulence characteristics, and to clarify the epidemic regularity of Aeromonas hydrophila which caused motile Aeromonas septicaemia outbreak (commonly known as disease outbreaks) in fish, 30 strains were isolated from 6 diseased fishponds which located in three different regions of Hubei province from 2006 to 2009. Among these strains, 20 were clinical strains (isolated from blood, liver, kidney or ascites fluid), 6 were intestinal strains and 4 were pond-water strains. A phylogenetic tree was constructed on the basis of the gyrB gene sequence of all 30 strains; the genetic typing of these strains were done through ERIC (enterobacterial repetitive intergenic consensus)-fingerprinting; the distribution patterns of seven virulence genes in these strains were tested by PCR method, including aerolysin (aerA), haemolysin (hlyA), heat-labile cytotonic enterotoxin (alt), heat-stable cytotonic enterotoxin (ast), elastase (ahpB), lipase (lip), and flagella (fla). In addition, the virulence of 15 representative strains was assayed in zebrafish by intraperitoneal injection. The results showed that regardless of the origin, all the 20 clinical strains, 1 intestinal strain and 3 pond-water strains had the same genetic characteristics. These included that clustered together in the phylogenetic tree, with 100% sequence similarities among these strains; have the same ERIC-finger-printing and the same virulence-gene pattern: aerA+hlyA+alt+ast+ahpB+lip+fla+; all of them were high virulent strains (LD50 9.74104 cfu/fish). Compared with clinical strains, the rest 5 intestinal strains and 1 pond-water strain either had different ERIC-fingerprintings or have different virulence-gene patterns, showing higher genetic diversity and lower virulence (LD501.01106 cfu/fish). These results indicated that as the pathogen of disease outbreaks, a clonal lineage of A. hydrophila was in popular within a certain time and areas, and no obvious variation or genetic diversity was found among these strains. This result would help in the clarification of the epidemic regularity of A. hydrophila underlying outbreaks, and help to make the right defense measures to prevent this infection. Meanwhile, the combined prevalence of multiple virulence genes in pathogenic strains of A. hydrophila laid the foundation for clarify the pathogenic mechanism underlie this infection. Moreover, the correlation of virulence and virulence-gene patterns of A. hydrophila showed that virulence genes can be chosen as gene-marker to detect pathogenic strains of this bacterium.
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Keywords:
- Diseased fishponds /
- Aeromonas hydrophila /
- Genetic diversity /
- Virulence gene /
- Virulence
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黄河上游河段总体上以高山峡谷地貌为主, 河道束窄, 水流湍急, 龙羊峡以上依次规划有三座水电站, 分别是茨哈峡水电站(规划梯级)、班多水电站(已建)、羊曲水电站(已建)。鱼类重要生境主要集中在局部宽谷河段, 其中班多水电站坝下至唐乃亥干支流河段及羊曲坝下河段为土著鱼类的重要产卵栖息场所, 分布有多种珍稀鱼类、国家保护鱼类、特有鱼类[1, 2]。受库区蓄水和下泄水量调控影响, 下游河道水深、流速等水文条件同天然河流发生很大变化, 进而对生物栖息环境造成影响[3]。水文特性是鱼类栖息地主要生境因子之一[4, 5]。河段水文情势的改变进一步对鱼类栖息生长和发育繁殖产生影响, 从而对河流生态系统的健康产生影响[6]。研究确定河流的生态流量, 制定合理的生态调度方案能有效缓解河流水文情势变化引发的生态问题, 是生态保护的重要措施之一[7, 8]。
目前, 全球范围内关于生态流量的研究方法超过200种[9], 大体分为水文学法、水力学法、栖息地模拟法和整体综合法。栖息地模拟法通过模拟流量与指示物种栖息地质量之间的定量关系, 可以获得物种不同生命阶段的生态流量[10, 11], 与其他计算方法相比, 具有明晰的物理机制, 因而得到了广泛应用。李建等[12]通过栖息地模拟确定了目标鱼种的产卵期生态需水量, 建立了流量与栖息地面积关系曲线, 为三峡及葛洲坝工程的生态调度提供建议。蒋红霞等[13]考虑不同水力条件下对鱼类不同生命时期的生态需水量, 通过PHABSIM模型计算出优势种的最佳生态流量, 并得以验证。蔡玉鹏等[14]以长江中华鲟作为目标物种, 采用二维水力学模型结合鱼类栖息地模型对中华鲟产卵场的栖息地条件进行了分析, 计算了中华鲟自然繁殖期间流量与栖息地加权可利用面积的关系, 得到了中华鲟自然繁殖适合生态流量。费启航等[15]选择四大家鱼作为汉江下游的指示物种, 模拟了不同流量下四大家鱼适宜栖息地状况的变化, 提出维持四大家鱼产卵期与生长期需求的生态流量及高流量脉冲。本研究选取黄河上游一规划梯级电站段鱼类产卵栖息的典型区域作为研究对象, 以厚唇裸重唇鱼为目标鱼类, 利用栖息地模拟法分析流量变化对鱼类栖息地的影响, 计算不同流量条件下目标鱼种的适宜栖息地面积, 基于鱼类生境质量分级方法分析不同流量响应鱼类生境质量的变化特征分析研究河段的生态流量, 进而为生态调度方案的制定提供参考依据。
1. 材料与方法
1.1 研究区域
根据规划, 茨哈峡水电站为季调节电站, 具有一定的调蓄能力; 下游的班多水电站为径流式电站, 无调节能力, 泄水主要受上游来水影响。根据规划梯级电站河段的重要生境分布, 该河段水量调度主要影响生境为班多坝下至唐乃亥河段, 作为本研究的目标区域(图 1)。
1.2 目标鱼类及其水深、流速适宜度曲线
根据潘文光等[16]的研究, 研究河段生态调度目标种类有8种, 其中生态调度需求得分最高的鱼类为厚唇裸重唇鱼(Gymnodiptychus pachycheilus)。本研究以厚唇裸重唇鱼的生境需求为目标进行栖息地模拟。
依据黄河上游的水域特征和的厚唇裸重唇鱼生活习性, 最适宜栖息的流速为0.4—1.0 m/s, 最适宜栖息的水深为1.2—3 m, 水深与流速适应性曲线见图 2。适宜性指数的数值为0—1, 1赋值为最适宜生存情况, 0赋值为最不适宜生存情况, 曲线的峰值区间则代表最适宜鱼类生存的范围[17]。
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图 2 厚唇裸重唇鱼流速和水深适宜度曲线Figure 2. Velocity and depth suitability curve of Gymnocheilus pachycheilus1.3 研究方法
利用HEC-RAS构建适用于目标调度河段水深、流速模拟的一维水动力学模型, 模拟预测不同来水流量及蓄水水位工况下, 目标调度河段的水深及流速分布情况。一维水动力计算的效率更高, 并且适应性更广, 降低了资料收集的难度, 但建模参数的选取和校准可能会对结果产生显著影响。因此在建模时应根据具体需求综合考虑各种因素, 以提高模拟结果的准确性和可靠性。
基于水动力学模型结果, 整合生态调度目标鱼类的栖息地适宜度曲线及生境适宜度评估规则, 采用CASiMiR-Fish栖息地模型, 模拟不同工况下的栖息地加权可利用面积, 具体计算方法如下:
以水动力模型模拟结果为基础, 将指示鱼类关键生境因子的适宜性指数与河道各水动力参数进行匹配计算, 得到Ｖi、Ｄi的适宜性值, 并对不同生境因子的适宜性值进行乘积计算得到综合适宜性值(CSF), 最后将CSF与对应的栖息地面积相乘, 得到加权可利用面积(WUA)。计算公式:
$$ \mathrm{CSF}_{ \mathit{i} } \mathrm= \mathit{Ｖ} _{ \mathit{i} } \mathrm{\times } \mathit{Ｄ} _{ \mathit{i} }\qquad \quad\;\; $$ (1) $$ \mathrm{W}\mathrm{U}\mathrm{A}=\sum _{\mathrm{i}=1}^{\mathrm{n}}({\mathrm{C}\mathrm{S}\mathrm{F}}_{i}\times {A}_{i}) $$ (2) 式中, CSFi为第i个单元格的综合适宜性值; WUA为研究河段的加权可利用面积; Ｖi、Ｄi分别为第i个单元格中流速、水深的适宜性值为0—1, 1代表最适宜; Ai表示第i个单元格的面积[18]。
1.4 工况选择及数据来源
(1)流量工况:
在厚唇裸重唇鱼的主要繁殖季节4—6月, 研究区域干流流量分布范围为150—2750 m³/s; 研究水域的全年流量为50—2800 m³/s, 本研究综合考虑去掉防洪调度流量工况, 选取50—2600 m³/s系列工况进行模拟分析。同时, 研究区域进口流量除干流上游来水外, 还有曲什安河、巴沟河的来流, 分别按照两条支流在主要繁殖季节的对应流量数值计入。
(2)水位工况:
研究区域主要受下游羊曲水库水位影响, 水位工况: 羊曲水库生态限制水位2710 m、至规划设计运行最高水位2715 m。
表 1 模拟工况Table 1. Simulated condition工况 水位(m) 流量(m3/s) 2710 50、150、200、400、515、600、800、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2200、2400、2600 2715 50、150、200、400、515、600、800、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2200、2400、2600 (3)边界条件:
模型上下游边界分别为班多断面和上才乃亥断面, 模型上游以流量作为边界条件, 下游边界以水位作为边界条件。采用不同的糙率系数进行试算, 经率定得到研究河段的糙率系数为0.038。并采用班多水位数据对模型进行验证, 相对误差在±3.6%以内, 模拟精度可满足要求。
(4)水下地形:
地理数据包含班多坝址至唐乃亥集中产卵河段的水下地形数据, 通过空间插值后模拟河道水下地形分布。精度为0.5, 断面间隔350 m。
2. 结果
2.1 水动力模拟结果分析
根据HEC-RAS一维水动力学模型模拟不同来水流量及蓄水水位工况下目标调度河段的水深及流速分布情况。研究河段部分典型流量下的水深和流速分布如图 3和图 4所示。
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图 3 研究河段2710及2715 m水位典型流量下的水深分布Figure 3. The water depth distribution of typical discharge under 2710 and 2715 m![]()
图 4 研究河段2710 及2715 m水位典型流量下的流速分布Figure 4. The velocity distribution of typical discharge under 2710 and 2715 m不同水位条件下研究河段的水深分布情况如图 3所示, 结果显示: 当流量在150 m³/s时, 在2710 m水位下, 大部分区域的水深处于9 m以下(许多河道点的水深在3 m以下, 适宜厚唇裸重唇鱼栖息的区域相对低流量时增多), 水深超过12 m河段的长度极少; 当水位在2715 m, 水深处于12 m以上的河道的长度明显增加。当流量在200 m3/s及以下时, 研究河段内水深在3 m以下的河段较多, 然而当流量在1200 m3/s及以上时, 研究河段内除部分边滩处的水深在3 m以下以外, 大部分河段的水深均大于3 m。
不同水位条件下研究河段的流速分布情况如图 4所示, 结果显示: 当流量在150 m³/s时, 在2710 m水位下, 研究河段内大部分区域的流速在0.5—1.5 m/s, 极少部分河段区域的流速在0.5 m/s以下, 主要分布在模拟分析区域的下游区域, 流速在0.5—1.5 m/s的区域明显增大; 当水位在2715 m, 大部分区域的流速在1.5 m/s以下, 低流速区域范围明显增大(处于厚唇裸重唇鱼适宜栖息流速范围内的区域明显增多)。从整个河道来看, 在河道的弯曲处流速较小, 在弯曲处的前后区域流速较大, 在窄深的顺直河道处流速较大。断面来看河道中间流速较大, 两边河岸处流速较小。
2.2 栖息地模拟结果分析
基于水动力模拟的结果, 采用CASiMiR-Fish栖息地模型, 模拟得到目标鱼类在生态调度目标河段栖息地适宜性分布结果。部分典型流量条件下厚唇裸重唇鱼在研究江段的栖息地适宜性分布结果如图 5所示。
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图 5 研究河段2710m及2715m水位典型流量下厚唇裸重唇鱼栖息地适宜性分布Figure 5. The habitat suitability distribution of Gymnodiplocheilus pachycheilus under 2710 and 2715 m厚唇裸重唇鱼研究江段内的栖息地适宜性指数的空间分布结果显示: 在相同流量下, 相比于2715 m水位, 2710 m水位时栖息地适宜性指数值大于0.6的区域更多, 保持羊曲水库在2710 m限制水位运行, 对于尽可能地增加厚唇裸重唇鱼适宜产卵场的生境面积具有重要的意义。同时, 对比分析发现, 在低流量时(50—200 m3/s), 适宜厚唇裸重唇鱼产卵的生境面积比高流量时更大。通常地, 厚唇裸重唇鱼在河道的两岸浅水处, 以及在岸滩和江心洲的周围都有适宜度比较高的绿色和蓝色斑块分布。
2.3 生态流量分析
根据各研究河段不同流量下厚唇裸重唇鱼栖息地模拟结果, 适宜栖息地面积(可加权利用面积,WUA)与流量的关系曲线如图 6所示。随着流量的增加, WUA呈现先增加, 然后再减少的趋势; 在2710 m水位条件下, 当流量在150 m3/s时, WUA最大, 为312005.16 m2; 在2715 m水位条件下, 当流量在170 m3/s时, WUA最大, 为194812.95 m2; 在相同流量条件下, 2715 m水位工况的WUA值均比对应的2710 m水位工况对应的的WUA值少, 减少范围为3.95%—76.26%, 其中流量在2600 m3/s时减少最少(该流量下两个水位工况的WUA均接近于0), 1200 m3/s时减少最多。
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图 6 不同工况下厚唇裸重唇鱼适宜栖息地面积(WUA)Figure 6. Optimum habitat area with thick and bare lips under different working conditions (WUA)当羊曲水库在2710 m水位运行时, 厚唇裸重唇鱼适宜生境面积(加权可利用面积, WUA)在不同流量条件下的变化的结果显示(图 6): WUA值最大时的流量为150 m3/s, 达到或大于50%最大WUA的流量范围为50—515 m3/s。可认为是厚唇裸重唇鱼在研究区域内形成较大面积产卵生境时的适宜流量范围[19, 20]。
3. 讨论
3.1 生态流量在实际中的验证
根据调查, 厚唇裸重唇鱼的繁殖季节为4—6月, 通过对2002—2022年研究区域下游唐乃亥断面不同月份的历史流量数据分析, 在4月份时, 绝大部分日期的流量数据处于50—515 m3/s; 在5月份时, 也有相对部分日期的流量数据处于50—515 m3/s; 然而在6月份时, 仅有少数部分日期的流量数据处于50—515 m3/s。结合生态流量分析的结果, 表明厚唇裸重唇鱼在研究河段形成较大面积产卵生境的月份应该是4—5月份, 而6月份形成的产卵生境较小。2022年4—6月在研究河段进行的鱼类早期资源结果也显示厚唇裸重唇鱼主要产卵月份应该是4—5月份, 而6月份仅有少量产卵事件[14]。由此也可以印证, 本研究得到的针对厚唇裸重唇鱼的50—515 m3/s生态流量调度范围是适宜的, 符合当地生境条件下营造适宜流量的需求。
3.2 生态流量研究
随着我国生态保护日益受到重视, 越来越多的梯级将生态调度同防洪调度、供水调度、发电调度等共同纳入综合调度系统, 减缓水利水电工程对水生环境、尤其是鱼类的不利影响[20—22]。我国近年来对多种重要鱼类的生态调度需求进行了研究, 如蔡玉鹏等[14]的研究表明中华鲟需要的生态流量为13000—15000 m3/s; 费启航等[15]的研究认为汉江下游四大家鱼产卵期每年提供至少２次持续时间不低于3d、流量不低于1310 m3/s的高流量脉冲, 以刺激四大家鱼自然产卵, 增加产卵规模; 赵晨旭等[24]的研究表明宽鳍鱲适宜生态流量为最适宜流量为47.8—54.3 m3/s。但整体而言, 我国鱼类生态调度需求的研究还较少, 除长江水系几种重要种类有基础研究外, 其他流域鱼类的调度需求资料还较为匮乏。本文以黄河上游重要土著鱼类厚唇裸重唇鱼的基础生态调查数据为基础, 通过水动力学模拟、栖息地模拟确定了针对该鱼种的生态流量需求, 可填补国内在黄河土著物种生态调度需求参数的空白, 为黄河上游梯级生态调度提供重要支撑。
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