南方鲇免疫球蛋白单克隆抗体的制备及特性
PRODUCTION AND CHARACTERIZATION OF MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST SILURUS MERIDIONALIS CHEN SERUM IMMUNOGLOBULIN
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摘要: 采用PEG 沉淀结合Sepharose-4B 柱层析法分离纯化了健康非免疫状态下南方鲇血清免疫球蛋白,在SDS-PAGE 电泳条件下血清免疫球蛋白重链和轻链的分子量分别约为77 kD 和27 kD。应用杂交瘤单克隆抗体技术制备了4 个南方鲇免疫球蛋白特异性的单克隆抗体细胞株, 并对这些单克隆抗体的特性进行了分析。经抗体亚级份测定, 其中IgG1 有2 株, IgG2a 有1 株, IgG2b 有1 株; 抗体滴度为104—106, 有三株单抗具有Western-blot 反应特性, 识别南方鲇免疫球蛋白的重链。4 株单抗都能特异地识别南方鲇、鲇的免疫球蛋白, 而与鲫、草鱼、罗非鱼、斑点叉尾、光泽黄颡鱼血清以及水产动物常见病原菌如气单胞菌、爱德华氏菌、弧菌、柱状屈桡杆菌、沙门氏菌及大肠杆菌等无任何交叉反应。单克隆抗体F4-A12 对纯化的南方鲇免疫球蛋白的检测灵敏度为31 ng。实验结果证明这些单抗具有高度特异、高度灵敏等特点, 可用于南方鲇免疫球蛋白的结构分析、免疫应答水平监测和病原诊断, 具有广阔的应用前景。Abstract: Monoclonal antibodies (MAb) to serum immunoglobulins (Ig) of fish are of immense use in understanding on the fish immune system and rapid identification of pathogens. Southern catfish (Silurus meridionalis Chen) is a unique and important culture fish in China. Literature review indicated that MAbs have not been developed against the Ig of Southern catfish. This paper described the purification and characterization of serum Ig on southern catfish, along with the development and characterization of MAbs against Ig on southern catfish. Serum Ig from healthy southern catfish was purified by 9% polyethylene glycol (PEG6000) precipitation and followed by Sepharose-4B gel column chromatography. SDS- PAGE analysis showed that molecular weight of heavy chain and light chain was approximately 77 kD and 27 kD respectively. The purified serum Ig of southern catfish was used as antigen to immunize Balb/c mice. After four times immunization, the spleen of immunized mouse was removed, and the spleenocytes were obtained and fused with myeloma cells by using PEG 4000. The hybrids were plated into 96 well tissue culture plates and observed for colony growth. After two weeks, wells with hybridomas were tested by ELISA for screening the antibody secreting cell. Four hybridoma cell lines which secrete MAbs against the Ig of southern catfish had been established. Culture supernatant of the four positive hybirdomas were collected and tested using the IsoStripTM Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit, the results showed that two of them were IgG1, one was IgG2a and one belonged to IgG2b. Ascites of four MAbs were obtained and titers ranged from 104 to 107 tested by ELISA. Standard procedures of Western blotting were used to determine the reactivity of the MAbs in hybridoma culture supernatants to reduced southern catfish serum Ig on a 10% gradient gel. Three of four Mabs were able to recognize the heavy chain of the Ig on Western blotting; the last one did have no reaction with reduced southern catfish Ig under low dilution condition, although it showed strong reactivity in ELISA under high dilution condition. Specificity of four MAbs was investigated by ELISA and Western blotting using different fish serum as antigen. Results from ELISA showed that all of them only specifically reacted with serum of Silurus meridionalis Chen and Silurus asotus, and did not have any cross reaction with serum of Ietalurus Punetaus, Peheobagrus nitidus, Cienoyharyngodoni dellus, Carrassius auratus and Oreochromis niloticu. Western blotting further proved that three of four MAbs were able to bind the heavy chain of Ig only from Silurus meridionalis Chen and Silurus asotus, and all MAbs had no reaction with serum Ig of the other fish. The reactivity of MAbs with the fish common bacterial pathogen was tested by ELISA using bacteria, such as Aeromonas, Edwardsiella, Vibrio, Flexibacter columnaris, Salmonella and Escherichia coli, as coating antigen, and all four MAbs had no reaction with those tested bacterial pathogen. The measuring sensitivity of the Mab MaF4-A12 to purified southern catfish Ig was as low as 31 ng. All of these results demonstrated that Mabs were highly specific and sensitive to the Ig of southern catfish, and had the great potential to be used for analyzing the structure of southern catfish Ig, monitoring the immunity level and pathogen diagnosis.
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Keywords:
- Silurus meridionalis Chen /
- Immunoglobulin /
- Monoclonal antibody
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高脂饲料虽然在一定程度上可以起到促进鱼体增长, 节约蛋白的作用, 但也带来了鱼体脂肪堆积, 免疫力下降[1]等问题, 严重制约了水产养殖的可持续发展[2]。因此, 研究鱼类的脂代谢过程, 改善养殖鱼的脂肪沉积情况, 已成为当前鱼类营养生理学研究的热点。众所周知, 脂肪组织沉积主要是由于脂肪细胞增生(增殖)和脂肪细胞肥大(分化)造成的[3]。因而, 脂肪细胞体外培养技术的建立对于鱼类脂代谢研究具有重要的意义。与哺乳动物相比, 鱼类细胞体外培养的研究工作起步较晚。鱼类脂肪细胞体外培养更是近几年才展开。迄今为止, 国外主要进行了虹鳟(Oncorhynchus mykiss)[4]、大黄鱼(Larimichthys crocea)[5]和真鲷(Pagrosomus major)[6, 7]等脂肪细胞培养的研究, 国内主要是吉红等[8]于2009年建立了草鱼脂肪细胞体外培养模型。
脂肪酸对脂肪细胞增殖分化的影响主要集中在哺乳动物上。研究人员发现DHA可以促进人体脂肪细胞中甘油的释放; 而3T3-L1的脂代谢又受到EPA的调控。Azain等[9]的研究表明, 共轭亚油酸可以对小鼠脂肪细胞起到促进增殖, 抑制分化的作用。相比较来说, 脂肪酸对鱼类脂肪细胞增殖与分化影响的研究相对较少。目前已见报道的是, n-3系不饱和脂肪酸可以调控草鱼脂肪细胞脂解, 并且这一过程与脂解相关基因和炎症基因的表达有关[10]。而脂肪酸对罗非鱼(Oreochromis niloticus)脂肪细胞增殖和分化影响的研究尚未见报道。
本文首次建立了罗非鱼脂肪细胞体外培养模型, 为研究罗非鱼脂代谢提供了新的技术和方法。在脂肪细胞增殖和分化过程中, 分别加入100 μmol/L的棕榈酸(PA)、油酸(OA)、亚油酸(LA)和亚麻酸(LNA), 分析比较外源性脂肪酸对罗非鱼脂肪细胞增殖和分化的影响。
1. 材料与方法
1.1 材料
仪器与试剂 仪器: 酶标仪(BIO-TEK), 普通PCR仪(My-Cycler, BIO-RAK), qPCR仪(CFX Connect, BIO-RAD), 微量紫外分光光度计(Thermo Nanodrop 2000), 全自动样品快速研磨仪(上海净信科技有限公司), 冷动离心机(Eppendorf centrifuge 5415R), SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台(苏州净化设备有限公司), 荧光倒置显微镜(日本Nikon)。
主要试剂: DMEM/F12, 100×双抗母液(10000 U/mL青霉素和10000 μg/mL链霉素), 1 mg/mL胰岛素, 胎牛血清(FBS): 美国Gibco公司; 牛血清白蛋白(BSA), Ⅱ型胶原酶, Krebs-Henseleit, 二甲基亚砜(DMSO), 棕榈酸(PA), 油酸(OA), 亚油酸(LA), α-亚麻酸(LNA): 美国Sigma公司; 吲哚美辛(Indomethacin), 地塞米松(Dexamethasone), 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(3-Isobutyl-1-methylxanthine), 油红O干粉, 异丙醇, 甲醛: 大连美伦生物技术有限公司。
实验材料 实验所用的罗非鱼购自上海市闵行区沧源水产市场, 体重约700—900 g。选择体质健壮, 游动活泼, 腹部饱满的罗非鱼作为实验鱼。
主要试剂的配制 (1)脂肪酸配制: 4种脂肪酸用无水乙醇稀释配制成100 mmol/L的母液, 并于–20℃保存备用。(2)消化液: 称取50 mg Ⅱ型胶原酶, 加入0.5 g牛血清白蛋白融入50 mL不含血清的DMEM/F12培养基中。(3)诱导剂配制: 吲哚美辛: 称取一定量吲哚美辛溶于DMSO致终浓度为0.2 mmol/L, –20℃保存备用。地塞米松: 称取一定量地塞米松溶于DMSO致终浓度为1 mmol/L, –20℃保存备用。3-异丁基-1-甲基黄嘌呤: 称取一定量3-异丁基-1-甲基黄嘌呤溶于DMSO致终浓度为0.5 mmol/L, –20℃保存备用。(4)诱导培养基成分: 诱导培养基1: 用15%FBS-DMEM/F12培养基配制终浓度为15 μg/mL胰岛素、0.2 μmol/L吲哚美辛、1 μmol/L地塞米松以及0.5 μmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤的诱导培养; 诱导培养基2: 用15%FBS-DMEM/F12培养基配制终浓度为15 μg/mL胰岛素的诱导培养基; 诱导培养基3: 15%FBS-DMEM/F12培养基。(5)油红O: 称取0.5 g油红O粉末溶于100 mL异丙醇中配成5 g/L的母液, 置于4℃避光长期保存, 用时以母液与水体积比为3﹕2稀释过滤后为工作液备用。
1.2 方法
罗非鱼脂肪细胞体外培养及分化模型的建立 无菌分离出罗非鱼腹腔脂肪组织, 于Krebs-Henseleit缓冲液(1% BSA)中剪碎并加入消化液, 28℃水浴震荡消化1.5h。分离除去结缔组织, 1000 r/min离心5—10min, 弃上清。用DMEM/F12缓冲液(1% BSA, pH 7.4), 洗3遍。裂解去除红细胞之后, 加入15%FBS-DMEM/F12培养基重悬剩余的细胞, 并接种到细胞板中, 密度为(2—3)×105个/mL, 28℃, 在5%CO2条件下培养7d细胞即可长至汇合阶段, 更换诱导培养基, 进行诱导分化。在诱导过程中, 先用诱导培养基1培养4d (第4天); 之后更换诱导培养基2继续培养4d (第8天); 最后更换诱导培养基3培养4d (第12天), 分化结束。诱导期间每2天换1次液。
脂肪酸对前脂肪细胞增殖的影响 将前脂肪细胞(2—3)×105个/mL培养在96孔板中, 添加100 μmol/L的PA、OA、LA、LNA检测脂肪酸对细胞增殖的影响。同时在增殖培养基中添加1%BSA以保护细胞。对照组添加等体积的无水乙醇与等质量的BSA。在培养的第2、第4、第6、第8天, 借助SRB方法检测细胞增殖情况。具体方法为, 用50% (v/v) TCA (三氯乙酸)固定细胞。加入0.4% (w/v) SRB溶液对细胞中的蛋白进行染色。之后加入100 μL的10 mmol/L Tris溶解细胞中的染料。读取515 nm处的吸光度值(Optical Density)。每个处理4个重复, 实验重复3次; 通过SRB实验确定对脂肪细胞的增殖影响后, qPCR检测脂代谢及增殖相关基因的表达。
脂肪酸对前脂肪细胞分化的影响 将前脂肪细胞(2—3)×105个/mL培养在48孔板中, 培养1周后进行诱导分化: 分别添加100 μmol/L的PA、OA、LA、LNA作用12d (第0至第12天), 每次换液均补充等量脂肪酸。分化结束用油红O染色检测罗非鱼脂肪细胞分化情况, 用Image Pro Plus6.0(IPP 6.0)测量胞内脂滴的数量和面积。qPCR检测分化过程中脂代谢基因的表达水平。
油红O染色 用4%的甲醛固定细胞, 60%异丙醇(v/v)润洗并晾干。加入油红O染料静置10min, 弃去油红O, 充分用清洗残余的染料。晾干, 加入200 μL的超纯水, 最后将细胞于显微下观察染色情况并拍照。
为了对以上的染色结果进行定量分析, 拍照后将细胞晾干, 加入100%异丙醇溶解油红O染料, 500 nm处用100%异丙醇调零检测吸光度值。
Real-time qPCR 操作方法 将前脂肪细胞(5—6)×105个/mL培养在6孔板中, 培养1周后进行诱导分化, 每次换液均补充等量脂肪酸。分化结束收后收集细胞, 使用Trizol法提取总RNA, 微量紫外分光光度计检测RNA纯度后, 保存在–80℃中。使用Prime Script RT Reagent Kit (Takara)试剂盒反转得到cDNA, 具体方法参考说明书。在NCBI上查找相应基因序列, 用primer 5.0设计引物, 由铂尚生物技术(上海)有限公司合成引物。引物设计如表 1所示。根据试剂盒说明书进行Real-time qPCR, 以β-actin为内参。
表 1 罗非鱼脂肪细胞增殖分化相关基因表达所用引物Table 1. Primers used in quantitative PCR引物名称
Primer引物序列
Sequence (5′—3′)c-fos ACACCACATTCAGCAAGAGGA
GCCACGAGTAGCAGAACCTc-myc GTATGAGTGGAAGGAGCGTCTA
CGGCGGTAGGTGATGTAGATCPT-1a TTTCCAGGCCTCCTTACCCA
TTGTACTGCTCATTGTCCAGCAGACPT-1b AAGGGACGTTACTTCAAGGTG
TCCGACTTGTCTGCCAAGATFAS TCATCCAGCAGTTCACTGGCATT
TGATTAGGTCCACGGCCACAATGL AAAACGTCCTGGTGACCCAGT
TAGGAGGAATGATGCCACAGTACAHSL AACCTGGATGTCCATTTCTGGAAG
TCGGTTTACCTTGACTTGAGTGGAMGL ACATCGTCAACGCAGACGGATT
CACAATGTTCCCCAGCTCCATCD36 ATCTTCGAACCATCCATGTCAGTG
GATATGTGATGCTGGAGGAAGCAAPPARγ TGGACTACACAAACATGCACAGC
CACGGGACTATCTGAGTACTGTGGAβ-actin CAGGATGCAGAAGGAGATCACA
CGATCCAGACGGAGTATTTACG采用公式处理qPCR结果: 目的基因mRNA相对表达量=2–ΔΔCt, 其中ΔΔCt=[Ct (目的基因)–Ct (β-actin)]。
1.3 数据统计分析
实验结果用平均值±标准差(Mean±SD)(n=3)来表示。使用SPSS19.0对数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA)用于揭示不同脂肪酸处理对细胞影响的差异, 字母(a、b、c)表示不同脂肪酸处理组之间存在显著性差异(P<0.05)。Studentt test用于检测脂肪酸处理组与对照组之间的差异, * 表示脂肪酸处理组与对照组之间存在显著性差异(P<0.05)。
2. 结果
2.1 罗非鱼腹腔脂肪细胞的增殖及分化过程中的形态学观察
如图 1所示, 刚接种贴壁的罗非鱼前脂肪细胞呈现透明圆形, 胞内无明显脂滴, 均匀分散在细胞板底部, 具有增殖和分化功能。中性脂肪细胞中脂滴明显, 无增殖功能, 在培养过程中, 会因通过裂解而分离出去(图 1A)。前脂肪细胞增殖培养3d, 形态发生变化并呈现梭形, 占据细胞板底一半的面积(图 1B)。培养7d后, 细胞边缘模糊, 增殖的脂肪细胞铺满整个细胞板底, 中性脂肪细胞大量减少(图 1C)。对细胞进行诱导分化, 12d后诱导结束, 进行油红O染色, 对细胞内的脂滴进行染色观察。镜下可见胞内被染为红色的清晰脂滴(图 1D)。
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图 1 脂肪细胞增殖及分化过程中的形态变化A. 开始贴壁的细胞; B. 培养3d细胞呈现不规则的梭形; C. 培养7d细胞铺满整个板底; D. 诱导培养12d油红O染色的细胞Figure 1. Morphology of preadipocyte and differentiated adipocytesA. Adherent cell; B. The cell began changing into unregulation shape of fusiform at day 3; C. The cells covered the entire bottom plate at day 7; D. Morphology of adipocytes at day 12 stained with oil red O2.2 不同脂肪酸对罗非鱼脂肪细胞增殖水平的影响
本实验采用SRB染色法检测外源性脂肪酸对罗非鱼脂肪细胞增殖的影响。如图 2所示, 4种脂肪酸在实验浓度条件下(100 μmol/L)对脂肪细胞的增殖起到不同程度的影响。由于在培养1周之后细胞数量处于相对稳定的状态, 所以我们检测脂肪酸处理8d后细胞的增殖情况, 结果表明, 不饱和脂肪酸(OA、LA、LNA)对脂肪细胞的促增殖作用较为显著, 饱和脂肪酸(PA)的促增殖能力较低。其中100 μmol/L的LNA对脂肪细胞的增殖效果最为明显。
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图 2 脂肪酸对脂肪细胞增殖的影响* 表示对照组与处理组之间存在显著性差异(P<0.05); 图中各组之间标注不同字母(a, b, c)表示不同脂肪酸处理组之间存在显著性差异(P<0.05), 下同Figure 2. Effects of fatty acids on adipocytes proliferationValues in groups with different letters are significantly different, P<0.05; the same applies below2.3 不同脂肪酸对脂肪细胞增殖和脂代谢相关基因表达的影响
如图 3所示, 培养8d后, 细胞增殖相关基因, c-myc和c-fos的表达显著性增高(P<0.05), 即细胞处于增殖活跃状态, 并且不饱和脂肪酸如油酸, 亚油酸和亚麻酸对前脂肪细胞的促增殖作用优于棕榈酸; 脂合成相关基因PPARγ和CD36的表达上调; 而脂肪酸合成基因FAS的表达下调, 且下调幅度随着脂肪酸不饱和程度的上升而增大; 值得注意的是, 脂解相关基因ATGL的表达显著上升(P<0.05), 同时,CPT-1a的表达也出现上调的趋势。
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图 3 脂肪细胞增殖过程中基因表达水平A. 增殖相关基因; B. 脂合成相关基因; C. 脂解相关基因Figure 3. Gene expression in the process of adipocyte proliferationA. Proliferation related genes; B. Adipogenesis related genes; C. Lipolysis related genes2.4 脂肪酸对脂肪细胞分化的影响
油红O染色检测罗非鱼前脂肪细胞分化情况。如图 4所示, 脂肪酸对脂肪细胞分化存在抑制作用, 且饱和脂肪酸(PA)的抑制作用最强。
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图 4 脂肪酸对脂肪细胞分化的影响A. 对照; B. 棕榈酸; C. 油酸; D. 亚油酸; E. 亚麻酸; F. 油红O洗脱液吸光度Figure 4. Effects of fatty acids on adipocytes differentiationA. Control; B. PA; C. OA; D. LA; E. LNA; F. OD value of Oil Red O elutio为了进一步分析脂肪酸抑制脂肪细胞分化的机制, 我们采用软件IPP 6.0对脂肪细胞中的脂滴面积、数量及面积进行定量计算。如图 5A、B, 加入外源性脂肪酸, 细胞中的脂滴面积有下降趋势, 而数量出现上升的趋势。另外, 将细胞内的单个脂滴的直径和面积进行比较, 我们发现脂肪酸处理组的细胞中脂滴的平均直径和面积均有下降的趋势, 而棕榈酸处理对细胞分化的抑制效果更加显著(图 5C、D)。
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图 5 脂肪酸对脂肪细胞脂滴形成的影响A. 单个脂肪细胞中脂滴面积(μm2); B. 单个脂肪细胞中脂滴数量(个); C. 脂肪细胞中单个脂滴面积(μm2); D. 脂肪细胞中单个脂滴直径(μm)Figure 5. Effects of fatty acids on lipid droplet formation in adipocyteA. Lipid area /per APC (μm2); B. Lipid number/per APC (N); C. Area/per lipid (μm2); D. Diameter/per lipid (μm)2.5 脂肪酸对脂肪细胞分化相关基因表达的影响
采用qPCR检测分化过程中相关基因表达。如图 6所示, 加入棕榈酸后, CPT-1a (P<0.05)和CPT-1b等β氧化相关基因的表达出现上调的趋势; 脂解相关基因ATGL显著下降; 而脂合成相关基因(FAS)的表达也出现下调的趋势。
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图 6 脂肪细胞分化过程中基因表达A. 脂肪酸β氧化相关基因; B. 脂解相关基因; C. 脂合成相关基因Figure 6. Gene expression in the process of adipocyte differentiationA. Fatty acid β-oxidation related genes; B. Lipolysis related genes; C. Adipogenesis related genes3. 讨论
3.1 罗非鱼脂肪细胞体外培养模型的建立
影响脂肪细胞增殖分化效果的因素主要包括提取方法, 培养基成分和培养及诱导时间。不同物种脂肪细胞的提取及培养条件各不相同。以哺乳动物为例, 人和牛脂肪细胞的消化时间通常为1.5h[12, 13], 而猪脂肪细胞则通常为1h[14]; 在鱼类中, 草鱼脂肪细胞的消化时间是50min[8], 大黄鱼脂肪细胞消化时间为1h[5]。本文罗非鱼脂肪细胞消化时间为1.5h。在培养基方面, 吉红等[8]在草鱼前脂肪细胞培养中, 使用含20% FBS的DMEM/F12培养基对脂肪细胞进行培养和诱导, 本文采用含15% FBS的DMEM/F12培养基, 而哺乳动物脂肪细胞培养基大多使用含10% FBS的DMEM/F12培养基。在细胞培养温度方面, 哺乳动物大多为37℃, 大西洋鲑的脂肪细胞通常培养在13℃中[15], 而虹鳟脂肪细胞为18℃[16], 草鱼脂肪细胞为28℃[8], 大黄鱼脂肪细胞也是28℃[5]。本文的罗非鱼脂肪细胞培养于28℃。因此本文在前人的基础上进一步摸索, 成功的构建了罗非鱼脂肪细胞体外培养模型。
3.2 脂肪酸对罗非鱼脂肪细胞增殖分化的影响
在建立罗非鱼脂肪细胞体外培养模型的基础上, 本文探讨不同脂肪酸对脂肪细胞增殖分化的影响。SRB染色实验证实, 脂肪酸可以促进脂肪细胞增殖, 且促增殖作用随着脂肪酸的不饱和程度的增加而增大。其中, 100 μmol/L的LNA的对前脂肪细胞的促增殖作用最为显著。相关基因表达数据表明, 细胞增殖基因c-myc和c-fos的表达量在外源脂肪酸的刺激下显著上升。孙超等[17]在哺乳动物上发现, 短链脂肪酸可以抑制3T3-L1的增殖, 长链脂肪酸对3T3-L1的增殖无显著影响; 陈蓉等[18]发现在一定浓度范围内的多不饱和脂肪酸可以抑制3T3-L1的增殖。而吉红等[19]证明不同浓度的EPA在2d内均能显著促进草鱼前体脂肪细胞增殖, 这与本研究的结果相一致。因此, 脂肪酸对细胞增殖的影响不但与脂肪酸的种类有关, 也与细胞的来源有关, 这也提示我们在鱼类的营养学研究中, 不能完全依赖哺乳动物的细胞系。
值得注意的是, 脂肪酸对前脂肪细胞增殖过程中脂代谢影响机制的研究相对较少。目前只有Distel等[20]的研究可以证明, 脂肪酸可以提高3T3-L1在增殖过程中的脂肪酸结合蛋白(FABP)的表达。这表明, 前脂肪细胞在增殖过程确实存在吸收胞外脂肪酸, 在胞内进行转化分解的可能。而我们的研究结果表明在外源性脂肪酸刺激下, 脂合成相关基因PPARγ和CD36的表达也出现了上调, 脂解相关基因CPT-1和ATGL表达上调, ATGL的表达量甚至出现显著性上升(P<0.05), 表明在增殖过程中, 脂肪细胞可以吸收环境中的脂肪酸, 用于自身代谢活动, 胞内脂质合成与分解都比较活跃, 有效促进细胞增殖。同时, 我们也注意到脂肪酸合成基因PPARγ与FAS表达出现相反趋势, 这有可能是因为细胞可以通过吸收外源脂肪酸以维持自身代谢, 因此脂质合成相关的过程没有被完全启动, 但其中的具体机制仍需进一步探讨。
在探究脂肪酸对脂肪细胞分化影响的实验中, 油红O染色结果显示, 脂肪酸对脂肪细胞分化起抑制作用, 且饱和脂肪酸的抑制作用要强于不饱和脂肪酸。使用IPP 6.0对细胞中脂滴数量和面积进行测量, 我们发现脂肪酸对胞内脂滴形成具有抑制作用。具体表现为加入脂肪酸处理的细胞, 脂滴的面积较小, 而数量较多。Manickam等[21]发现EPA可以显著降低3T3-L1脂肪细胞中脂滴的大小及脂质含量。这与我们的结果一致。因此, 我们认为脂肪酸抑制脂肪细胞分化, 可能是通过抑制脂滴体积的增大, 从而阻止较小脂滴融合为较大脂滴。
而定量PCR结果表明, 在细胞分化过程中添加脂肪酸, 细胞中β氧化相关基因表达水平有所上调, 而脂解基因ATGL表达下调。与我们的结果类似, Flachs等[22]发现DHA和EPA可以促进小鼠白色脂肪组织中线粒体生成和β氧化的进行。吉红等[19]发现EPA处理的草鱼脂肪细胞分化能力下降, 且PGC-1α的表达被激活, PGC-1α的高表达可以提高细胞线粒体的增殖发育, 进而促进胞内脂肪酸的氧化分解。这些结果表明, 罗非鱼脂肪细胞分化过程中, 脂肪酸通过加快胞内β氧化的进行, 减少胞内脂滴积累, 进而抑制细胞的分化, 但具体的信号通路还需进一步研究。
本研究建立了罗非鱼脂肪细胞作为模型, 同时发现不同饱和度的外源性脂肪酸对于细胞的增殖和分化有不同的效应, 其中饱和脂肪酸更倾向于促进细胞分化, 而高不饱和脂肪酸则倾向于促进细胞的增殖。这也为我们解释不同鱼体对于脂质的利用策略提供了必要的细胞学数据。
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